一种真菌制造技术

本发明专利技术公开了一种真菌

【技术实现步骤摘要】
一种真菌milRNA功能鉴定方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种真菌
milRNA
功能鉴定方法
。

技术介绍

[0002]短串联模拟靶标
(short tandem target mimic
，
STTM)
技术原理类似于现有的“miRNA
海绵”或
RNA
诱饵技术，被称为“坚韧的诱饵
(TuD)RNA”，该技术提供了阻断特定
miRNA
的有效方法
。STTM
技术通过设计一种含启动子的短串联片段，与目标
miRNA
相结合形成类似发夹的稳定结构，使目标
miRNA
调控的靶基因功能改变进而影响到生物的性状表现，根据这一原理对试验对象的
miRNA
功能等进行研究
。
目前
STTM
技术已被用于动物
/
植物
/
真菌等多种生物的
miRNA
功能鉴定，在植物和动物细胞中提供了阻断特定
miRNA
的有效方法
。
[0003]许多真菌
milRNA(micro like RNA)
可能有多个功能重叠的成员分布在基因组中，
milRNA
可能调节多种靶基因功能
。
真菌
milRNA
接近于植物
miRNA
，而真菌
milRNA
的靶向预测较困难，真菌
milRNA
是通常是来源于一个家族的基因组的功能性或非编码基因的区域，因此很难应用传统方法研究其功能
。
目前已有的一些
miRNA
功能研究技术可能对真菌
milRNA
不起作用，这些技术包括：探索植物
miRNA
功能的
STTM
技术
、
通过构建和表达
milRNA
抗性靶标来表征转基因系以及包括沉默突变在内的基因突变
。
因而，申请人希望开发一种利用
STTM
技术对真菌
milRNA
功能进行研究的全新方法
。
[0004]目前，同类
STTM
技术多用于动植物品种改良，改良农产品品质，提高抗逆性等方面，或作为基因工程的工具，如公开号为
CN202110252863
的专利技术专利公开了一种用于干扰目的基因表达的
STTM
方法；公开号为
CN201811094016、CN201310695733
的专利技术通过
STTM
技术获得转基因植株；公开号为
US201816140179A、US201414505378A、CN201710172193
的专利利用该技术提高作物抗病性
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服现有技术的不足而提供一种真菌
miRNA
功能鉴定方法，通过
STTM
技术研究部分种类真菌中
milRNA
的功能，通过
STTM
结构抑制真菌的目标
milRNA
，引起真菌表型的变化，从而推断目标
milRNA
的功能
。
[0006]为解决上述问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]本专利技术通过高通量测序获得研究对象真菌的
milRNA
序列，根据需要研究的目标
milRNA
结构设计出与之匹配的
STTM
结构，通过
STTM
结构与目标
milRNA
片段特异性结合形成一类似发夹结构，从而捕获真菌中大部分目标
milRNA
，使目标
milRNA
对真菌靶基因表达的调控作用发生改变，从而改变菌株性状，推断出目标
miRNA
在此类菌株中的调节功能
。
从而得到一种可鉴定真菌中
miRNA
功能的
STTM
方法
。
[0008]本专利技术公开一种
STTM
结构，包含如下
RNA
序列结构：
[0009]5’‑
靶
milRNA
互补结合序列一
‑
间隔序列
‑
靶
milRNA
互补结合序列二
‑3’
；
[0010]所述
RNA
序列自发形成倒
T
状结构，所述倒
T
状结构中竖直部为间隔序列形成的发
夹结构；所述靶
milRNA
为真菌
milRNA。
[0011]优选地，所述靶
milRNA
互补结合序列一和靶
milRNA
互补结合序列二内均含有非切割序列，所述非切割序列不与靶
milRNA
互补结合且不被
RNA
诱导的沉默复合物切割
。
[0012]具体地，所述非切割序列至少包括三个连续的核苷酸；所述非切割序列的第一个核苷酸位于靶
milRNA
互补结合序列一或靶
milRNA
互补结合序列二的第
10
或
11
位
。
[0013]优选地，所述间隔序列的长度为
48
～
96nt
，所述
RNA
序列结构的长度至少为
100nt。
[0014]本专利技术另一方面公开一种转录上述
STTM
结构的重组基因，重组基因的序列如
SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.2
所示，所述重组基因的5’
端和3’
端均设有限制性内切酶酶切位点
。
[0015]基于上述重组基因构建一种重组载体，重组载体由原始载体内插入上述重组基因获得，所述重组基因5’
端限制性内切酶酶切位点上游设有启动子，所述重组基因3’
端限制性内切酶酶切位点下游设有终止子
。
[0016]在一些实施例中，所述载体为质粒或噬菌粒；所述启动子为真菌聚合酶
II/III
启动子
(
分别为
SNR52/U6)
，所述终止子为
trpC
终止子
/poly(T)
终止子
。
[0017]具体地，所述质粒为含有铵草膦酸盐抗性基因的质粒
pDHt SK
或含有苯菌灵抗性基因的质粒
pDHt
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
STTM
结构，其特征在于，包含如下
RNA
序列结构：5’‑
靶
milRNA
互补结合序列一
‑
间隔序列
‑
靶
milRNA
互补结合序列二
‑3’
；所述
RNA
序列自发形成倒
T
状结构，所述倒
T
状结构中竖直部为间隔序列形成的发夹结构；所述靶
milRNA
为真菌
milRNA。2.
根据权利要求1所述的
STTM
结构，其特征在于，所述靶
milRNA
互补结合序列一和靶
milRNA
互补结合序列二内均含有非切割序列，所述非切割序列不与靶
milRNA
互补结合且不被
RNA
诱导的沉默复合物切割
。3.
根据权利要求2所述的
STTM
结构，其特征在于，所述非切割序列至少包括三个连续的核苷酸；所述非切割序列的第一个核苷酸位于靶
milRNA
互补结合序列一或靶
milRNA
互补结合序列二的第
10
或
11
位
。4.
根据权利要求3所述的
STTM
结构，其特征在于，所述间隔序列的长度为
48
～
96nt
，所述
RNA
序列结构的长度至少为
100nt。5.
一种转录权利要求1～4中任一项所述
STTM
结构的重组基因，其特征在于，重组基...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹伟，胥振国，范高福，方丽波，杨汶静，
申请(专利权)人：合肥职业技术学院，
类型：发明
国别省市：