一种基于菌群的肝癌非侵入性标志物筛选方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于菌群的肝癌非侵入性标志物筛选方法及应用，涉及细胞筛选检测技术领域

【技术实现步骤摘要】
一种基于菌群的肝癌非侵入性标志物筛选方法及应用


[0001]本专利技术涉及细胞筛选检测
，更具体地说，它涉及一种基于菌群的肝癌非侵入性标志物筛选方法及应用。

技术介绍

[0002]肝癌的早期诊断仍需准确性更高的标志物。目前多项研究提出了肝细胞癌的诊断标志物，除了传统的AFP外，还有外周血ctDNA，外泌体，DNA甲基化，肠道菌群等。其中肠道菌群作为肝癌标志物具有广泛的前景，由于肝肠轴的生理性解剖和多项顶级研究证实了肠道菌群及其代谢产物在肝癌发生发展中的影响，基本已经确立了肠菌和肝癌的相关性，但肠道菌群作为肝癌标志物还存在一些不足之处，需要进一步的队列研究数据来证实。
[0003]多部位人体样本结合多种测序技术溯源菌属标志物。采集了肝癌患者配对的的口腔拭子标本、粪便标本和肿瘤标本，通过16S rRNA技术和5R 16S两种测序方式，筛选出口腔菌群标志物和粪便菌群标志物，并验证肿瘤中也存在这些细菌。相较以往单纯肠道菌群作为标志物来说，我们的多样本和多技术筛选方法不仅筛查到和肝癌关联更强的标志物，还进一步验证了这些标志细菌在肿瘤中也是存在的，这一方法目前未见文献报道和相关专利。
[0004]现有的筛选菌群作为肝癌诊断标志物的方法，几乎全部是单一样本，其中大多数为粪便样本中的肠道菌群，研究结果多为相关性，没有进一步探索这些细菌标志物的来源和去向，也未见使用同一队列患者的配对口腔、粪便和肿瘤组织同时检测细菌来互相佐证菌群标志物的多部位存在。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种基于菌群的肝癌非侵入性标志物筛选方法及应用，采用患者不同部位的菌群样本，并使用广泛使用的16SrRNA测序技术和专门针对肿瘤内微量细菌的5R 16S测序技术，检测出的不同部位的细菌存在一定交集，这给构建基于这些细菌的标志物群提供了更可靠的依据。
[0006]本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种基于菌群的肝癌非侵入性标志物筛选方法，包括如下步骤：
[0007]S1：将回顾性发现队列与前瞻性验证队列进行组合；通过前瞻性队列中肿瘤样本的5R 16S测序技术、IHC和FISH进一步证实标志物菌群存在于肝肿瘤中，完善证据链；
[0008]S2：对步骤S1进行组合后队列的收集的生物样本进行测序；提取DNA检测，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增基因序列，然后进行产物纯化、制备文库并对样本序列进行质检；质检合格的样本将上机测序，得到原始的下机数据，利用重叠区将双端数据进行拼接，并进行质控、嵌合体过滤，获得高质量的有效数据；
[0009]S3：通过“去重复”，获得DADA2单碱基精度的代表序列；对DADA2进行去噪，然后使用ASVs的概念构建类OTU表，获得最终的特征表以及特征序列，进一步进行多样性分析、物
种分类注释和差异分析；
[0010]S4：随机森林模型筛选肝癌诊断标志菌群；通过16S rRNA测序技术获得菌群测序数据，然后根据随机森林模型的结果挑选菌群诊断标志物。
[0011]本专利技术进一步设置为：回顾性发现队列收集的为肝癌患者和体检中心人员的口腔、粪便样本；空腔样本为120例健康空腔对照样本和59例肝癌患者口腔样本；粪便样本为40例健康粪便对照样本和305例肝癌患者粪便样本；前瞻性队列收集的肝癌患者和健康体检人员的配对口腔、粪便和肿瘤样本，包括124例健康对照和91例肝癌患者对照样本。
[0012]本专利技术进一步设置为：将该肝癌非侵入性标志物筛选方法应用于口腔
‑
肠道
‑
肿瘤菌群的肝癌非侵入性标志物的筛选。
[0013]综上所述，本专利技术具有以下有益效果：
①
本技术同时采用患者不同部位的菌群样本，并使用广泛使用的16S rRNA测序技术和专门针对肿瘤内微量细菌的5R 16S测序技术，检测出的不同部位的细菌存在一定交集，这给构建基于这些细菌的标志物群提供了更可靠的依据。
②
此外，我们采用300余例患者一一对应的样本进行测序，避免了不同部位样本来自不同患者人群所引起的差异，结果也比单一样本更加可靠。
③
我们设计的队列包括一个发现队列(回顾性研究队列)，从回顾性队列筛选到的菌群标志物在新的前瞻性队列中得到验证，这从临床研究的角度评估具有较高的证据等级。
④
我们在测序筛选出菌群的同时，进一步通过免疫组织化学(IHC)和荧光原位杂交(FISH)技术检测了肿瘤组织和非肿瘤组织的样本，发现测序到的菌确实能够通过IHC和FISH技术显示，更加确认我们筛选到的肝癌细菌标志物就存在于肝癌组织中。
附图说明
[0014]图1是本专利技术实施例中回顾性和前瞻性队列研究的设计框架以及包含的各类样本的数量图；
[0015]图2是本专利技术实施例中细菌16S区域说明图；
[0016]图3是本专利技术实施例中16S rRNA测序的实验流程；
[0017]图4是本专利技术实施例中通过随机森林方法分别从回顾性队列的测序样本中寻找的对区分肝癌和健康人有贡献的TOP20的菌属；
[0018]图5是本专利技术实施例中前瞻性队列中通过线性判别分析(LEfSe)寻找的口腔和粪便样本的差异菌群，并通过进化树的形式表现；
[0019]图6是本专利技术实施例中5R 16S测序中多重5R PCR扩增区域示意图；
[0020]图7是本专利技术实施例中SMURF分析流程图；
[0021]图8是本专利技术实施例中癌和相应的癌旁组织以及良性对照肝脏组织的菌群检测情况图；
[0022]图9是本专利技术实施例中显示革兰氏阳性菌(LTA)和革兰氏阴性菌(LPS)的癌和癌旁组织免疫组织化学染色图；
[0023]图10是本专利技术实施例中FISH染色肿瘤及癌旁组织中代表性菌的图片；
[0024]图11是本专利技术实施例中构建的以菌群为标志物的诊断模型的诊断效率，包括分别用口腔菌群标志物，粪便菌群标志物，二者结合后的标志物以及进一步结合目前肝癌筛查最常用的标志物AFP后的效率。
具体实施方式
[0025]以下结合附图1
‑
11对本专利技术作进一步详细说明。
[0026]实施例：一种基于菌群的肝癌非侵入性标志物筛选方法及应用，如图1
‑
11所示，包括如下步骤：
[0027]S1：将回顾性发现队列与前瞻性验证队列进行组合；通过前瞻性队列中肿瘤样本的5R 16S测序技术、IHC和FISH进一步证实标志物菌群存在于肝肿瘤中，完善证据链；
[0028]S2：对步骤S1进行组合后队列的收集的生物样本进行测序；提取DNA检测，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增基因序列，然后进行产物纯化、制备文库并对样本序列进行质检；质检合格的样本将上机测序，得到原始的下机数据，利用overlap将双端数据进行拼接，并进行质控、嵌合体过滤，获得高质量的cleandata；
[0029]S3：通过“去重复”，获得DADA2单碱基精度的代本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于菌群的肝癌非侵入性标志物筛选方法，其特征是：包括如下步骤：S1：将回顾性发现队列与前瞻性验证队列进行组合；通过前瞻性队列中肿瘤样本的5R 16S测序技术、IHC和FISH进一步证实标志物菌群存在于肝肿瘤中，完善证据链；S2：对步骤S1进行组合后队列的收集的生物样本进行测序；提取DNA检测，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增基因序列，然后进行产物纯化、制备文库并对样本序列进行质检；质检合格的样本将上机测序，得到原始的下机数据，利用重叠区将双端数据进行拼接，并进行质控、嵌合体过滤，获得高质量的有效数据；S3：通过“去重复”，获得DADA2单碱基精度的代表序列；对DADA2进行去噪，然后使用ASVs的概念构建类OTU表，获得最终的特征表以及特征序列，进一步进行多样性分析、物种分类注释和差异分析；S4：随机森林模型筛选肝癌诊断...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈钢，杨金奂，王怡，何其宽，薄志远，陈凯文，陈紫烟，李佳靓，陈恺愉，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：