肝衰竭生物标志物的筛选方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物标志物领域，具体涉及一种肝衰竭生物标志物的筛选方法及其应用

【技术实现步骤摘要】
肝衰竭生物标志物的筛选方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物标志物领域，具体涉及一种肝衰竭生物标志物的筛选方法及其应用
。

技术介绍

[0002]肝脏是人体最大的消化腺，具有合成
、
解毒
、
代谢
、
分泌
、
生物转化以及免疫防御等多种功能
。
肝衰竭又名成肝功能衰竭，当肝脏受到致病因素（如肝炎病毒
、
酒精
、
中药等）引起严重损害时，造成肝细胞大量坏死超过其自身修复能力，导致肝脏功能发生严重障碍或失代偿，进而出现以凝血机制障碍和黄疸
、
肝性脑病
、
腹水等为主要表现的一组临床症候群
。
肝衰竭根据病理组织学特征和病情发展速度分为急性肝衰竭（
ALF
）
、
亚急性肝衰竭（
SALF
）
、
慢加急性
(
亚急性
)
肝衰竭（
ACLF
）和慢性肝衰竭（
CLF
）
。
肝衰竭的主要临床症状表现为极度乏力
、
纳差
、
腹胀
、
恶心
、
呕吐
、
神志改变等，由于病情进展迅速，治疗难度高，整体预后差，国内有研究报道急性肝衰竭
、
亚急性肝衰竭
、
慢性肝衰竭病死率分别为
87.8%、69.3%、66.5%。
[0003]由于肝衰竭的预后很差，因此寻找新的早期诊断肝衰竭的生物标志物显得十分必要，对于肝衰竭的早诊断早治疗，降低病死率具有重要意义
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一是在血液样本水平上提供一种肝衰竭生物标志物的筛选方法，即采用质谱分析的方法检测小分子蛋白质的含量来诊断肝衰竭
。
该方法简单，实用，且通过多种小分子的检测可以更好地提高检测方法的灵敏度与特异性
。
[0005]为实现上述目的，本专利技术肝衰竭生物标志物的筛选方法采取下述技术方案：一种肝衰竭生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：（1）样本预处理，取出保存在
‑
80℃
下的血液样本，解冻；待解冻完全后，采用
4℃
的
PBS
清洗，清洗干净后，加入
ddH2O
后匀浆，涡旋，加入体积比为1：1的甲醇：乙腈溶液；涡旋
60s
，超声破碎2次，放置
‑
20℃
冰箱孵育后，
15000rcf
，
4℃
离心，将上清液冷冻干燥，制成冻干粉并置于
‑
80℃
下备用；（2）色谱
‑
质谱分析，将上述备用的冻干粉用体积比为1：1乙腈：水溶液复溶，然后，利用超高效液相色谱系统并联合
HILIC
色谱柱进行样本分离，采用
6550
质谱仪进行检测，再采用
6600
质谱仪鉴定代谢产物；（3）数据处理，经
ProteoWizard
将原始数据转换成
.mzXML
格式，然后采用
lc
‑
ms spectra annotation
软件进行峰对齐
、
保留时间校正以及峰面积的提取，采用精确质量数匹配（
<25 ppm
）和二级谱图匹配的方式对小分子的结构进行鉴定；（4）显著性差异分子筛选，根据
OPLS
‑
DA
模型，以
VIP>1
为筛选标准，初步筛选出差异分子产物；采用多维度统计分析，筛选
VIP>1、Fold change>2
或
<0.5
的分子产物，并且单维度
T
检验统计分析
P value<0.05
的分子产物，即可得到具有显著性差异的分子蛋白质
。
[0006]优选地，步骤（2）中，液相色谱系统的参数设置如下：柱温为
25℃、
流速为
0.3 mL/min、
上样量为2μ
L
；流动相由两相组成：流动相
A
为含有
25 mM
乙酸铵和
25 mM
氨水的水溶液，流动相
B
为纯乙腈；样本采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～
0.5 min
，
95% B
；
0.5
～
7min
，
95%B
～
65%B
；7～
8 min
，
65%B
～
50%B
；8～
9 min
，
50%B
；9～
9.1 min
，
50%B
～
95%B
；
9.1
～
12 min
，
95%B
，整个分离过程中样本均置于
4℃。
[0007]优选地，步骤（2）中，
6550
质谱仪检测在电喷雾电离正离子模式下进行，其
ESI
源设置参数为，
Drying gas
流速：
16 L/min
，
Gas
温度：
250℃
，
Sheath gas
温度：
500℃
， sheath Gas
流速：
12 L/min
，
Nebulizer
：
20 psig
，
Vcap
：
3000 V
，
Nozzle
电压：
175 V
，
Mass Range
：
50
～
1200 Da
，
Acquisition rate
：
4 HZ
，每个循环的时间：
50ms。
[0008]进一步优选地，步骤（2）中，样本经
6550
质谱仪进行检测后，通过
6600
质谱仪鉴定，同时采集
QC
样本的一级谱图和二级谱图；
6600
质谱仪的
ESI
源设置参数为：
Gas1
，
50
；
Gas2
，
80
；
source temperature
，
650℃...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种肝衰竭生物标志物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）样本预处理，取出保存在
‑
80℃
下的血液样本，解冻；待解冻完全后，采用
4℃
的
PBS
清洗，清洗干净后，加入
ddH2O
后匀浆，涡旋，加入体积比为1：1的甲醇：乙腈溶液；涡旋
60s
，超声破碎2次，放置
‑
20℃
冰箱孵育后，
15000rcf
，
4℃
离心，将上清液冷冻干燥，制成冻干粉并置于
‑
80℃
下备用；（2）色谱
‑
质谱分析，将上述备用的冻干粉用体积比为1：1乙腈：水溶液复溶，然后，利用超高效液相色谱系统并联合
HILIC
色谱柱进行样本分离，采用
6550
质谱仪进行检测，再采用
6600
质谱仪鉴定代谢产物；（3）数据处理，经
ProteoWizard
将原始数据转换成
.mzXML
格式，然后采用
lc
‑
ms spectra annotation
软件进行峰对齐
、
保留时间校正以及峰面积的提取，采用精确质量数匹配
<25 ppm
和二级谱图匹配的方式对小分子的结构进行鉴定；（4）显著性差异分子筛选，根据
OPLS
‑
DA
模型，以
VIP>1
为筛选标准，初步筛选出差异分子产物；采用多维度统计分析，筛选
VIP>1、Fold change>2
或
<0.5
的分子产物，并且单维度
T
检验统计分析
P value < 0.05
的分子产物，即可得到具有显著性差异的分子蛋白质
。2.
根据权利要求1所述的肝衰竭生物标志物的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，液相色谱系统的参数设置如下：柱温为
25℃、
流速为
0.3 mL/min、
上样量为2μ
L
；流动相由两相组成：流动相
A
为含有
25 mM
乙酸铵和
25 mM
氨水的水溶液，流动相
B
为纯乙腈；样本采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～
0.5 min
，
95% B
；
0.5
～
7min
，
95%B
～
65%B
；7～
8 min
，
65%B
～
50%B
；8～
9 min
，
50%B
；9～
9.1 min
，
50%B
～
95%B
；
9.1
～
12 min
，
95%B
，整个分离过程中样本均置于
4℃。3.
根据权利要求1所述的肝衰竭生物标志物的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，
6550
质谱仪检测在电喷雾电离正离子模式下进行，其
ESI
源设置参数为，
Drying gas
流速：
16 L/min
，
Gas
温度：
250℃
，
Sheath gas
温度：
500℃
， sheath Gas
流速：
12 L/min
，
Nebulizer
：
20 psig
，
Vcap
：
3000 V
，
Nozzle
电压：
175 V
，
Mass Range
：
50
～
1200 Da
，
Acquisition rate
：
4 HZ
，每个循环的时间：
50ms。4.
根据权利要求3所述的肝衰竭生物标志物的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，样本经
6550
质谱仪进行检测后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛晨，何玉婷，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：