乳制品中鼠李糖乳杆菌活菌数字制造技术

本发明专利技术公开了一种乳制品中鼠李糖乳杆菌活菌数字

【技术实现步骤摘要】
乳制品中鼠李糖乳杆菌活菌数字PCR定量检测方法


[0001]本专利技术属于微生物
，具体地说，是一种乳制品中鼠李糖乳杆菌活菌数字
PCR
定量检测方法
。

技术介绍

[0002]鼠李糖乳杆菌
(L.rhamnosus)
多存在于人和动物的肠道内，细菌分类学属于乳杆菌属，鼠李糖亚种，是厌氧耐酸
、
不产芽孢的一种革兰氏阳性益生菌
。
鼠李糖乳杆菌不能利用乳糖，可发酵多种单糖
(
葡萄糖
、
阿拉伯糖
、
麦芽糖等
)
，大多数菌株能产生少量的可溶性氨，但不产生吲哚和硫化氢，它具有耐酸
、
耐胆汁盐
、
耐多种抗生素等生物学特点
。
鼠李糖乳杆菌作为重要的益生菌被广泛用于食品中，如：非常有名的
LGG
株，
1983
年由美国北卡罗来纳州立大学的两名教授
(Gorbach and Goldin)
自健康人体中分离出来，并获得专利
。
研究发现，该菌株耐酸
、
耐胆盐
、
肠道定值能力强，具有预防治疗腹泻，提升免疫力，并且只产生
L
型乳酸，易于代谢，口味好
。
在我国也自主研发鼠李糖乳杆菌益生菌株，在乳制品中添加鼠李糖乳杆菌成为新的发展趋势
。
[0003]微滴式数字
PCR
技术
(droplet digital polymerase chain reaction
，
ddPCR)
是近年来新发展起来的定性定量分子检测新方法，用于转基因成分
、
食品中致病菌
、
掺假产品等的检测，以及在临床上用于肿瘤细胞的检测
。1992
年，
Sykes
等就首次提出了
ddPCR
的构想，是一项基于单分子目标基因
PCR
扩增的绝对定量技术，主要原理是将含有
DNA
模板的
PCR
反应体系分布到大量的独立反应室，单分子间通过大量稀释后分离，使得每个独立反应室中含有小于或等于一个拷贝，然后使这些反应室在相同条件下独自进行
PCR
扩增
。
含有
DNA
分子的微反应室能够发生
PCR
反应，即产生阳性信号；而不含
DNA
的微反应室则产生阴性信号，再利用泊松分布，逐一对阳性信号的微反应室计数，从而计算出样品中初始的
DNA
模板量
。
[0004]ddPCR
技术以其准确性好
、
灵敏度高
、
无需任何校准物质
、
可进行绝对定量等优势，已经在临床诊断
、
基因表达
、
环境微生物检测等方面得到了广泛的研究和应用
。

技术实现思路

[0005]为实现对鼠李糖乳杆菌的特异性检测和绝对定量分析，本申请的专利技术人选取了鼠李糖乳杆菌具有种内保守属间特异的染色体单拷贝区域序列
CDS17
和
CDS18(Accession No.CP067365.1)
作为靶序列，设计了两组引物和探针组合
。
经
qPCR
验证，其对于鼠李糖乳杆菌具有很好的特异性，并且经
ddPCR
验证，用于鼠李糖乳杆菌检测时具有良好的重复性
。
[0006]为此，本专利技术的第一个目的，在于提供一种乳制品中鼠李糖乳杆菌活菌数字
PCR
定量检测方法，使用以下引物和探针序列：
[0007]正向引物
LRCDS17F
：
TCTTGGCAGTGGCGTCACT
；
[0008]反向引物
LRCDS17R
：
AAATCGAAGCAGCTAACACTGAAGT
；
[0009]探针
LRCDS17P
：
TTTCGCCATTCTTTGCATCAATCTGCTT。
[0010]进一步的，所述数字
PCR
的反应体系如下：
[0011]ddPCR master mix for Probes(no dUTP)10
μ
L
，上
、
下游引物各
1.5
μ
L(
终浓度
750nmol/L)
，探针
0.5
μ
L(
终浓度
250nmol/L)
，经
PMA
处理后的样品
DNA
模板5μ
L
，用双蒸水补足总体积
20
μ
L
；
[0012]所述数字
PCR
的扩增反应条件如下：
[0013]95℃
预变性
10min
；
94℃
变性
30s
，
55
～
60℃
退火
1min
，
45
个循环；
98℃
固化微滴
10min。
[0014]根据本专利技术的优选实施例，所述用于处理样品
DNA
的
PMA
的浓度为
20
μ
g/mL。
[0015]根据本专利技术的优选实施例，所述数字
PCR
测定结果与对应样品的菌悬液浓度的换算公式如以下式
(1)
：
[0016][0017]式
(1)
中：
C1为对应菌悬液浓度
(CFU/mL)
；
N
为
20
μ
L ddPCR
反应体系中测得的核酸拷贝数
(
拷贝
/20
μ
L)
；
V1为提取核酸的最终定容体积
(
μ
L)
；
V2为
ddPCR
反应体系中加入的核酸模板体积
(
μ
L)
；
V3为提取的菌悬液体积
(mL)。
[0018]本专利技术的第二个方面，提供了一种用于乳制品中副干酪乳杆菌活菌数字
PCR
定量检测的引物和探针，所述引物和探针的序列如下：
[0019]正向引物
LRCDS17F
：
TCTTGGCAGTGGCGTCACT
；
[0020]反向引物
LRCDS17本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种乳制品中鼠李糖乳杆菌活菌数字
PCR
定量检测方法，其特征在于，使用以下引物和探针序列：正向引物
LRCDS17F
：
TCTTGGCAGTGGCGTCACT
；反向引物
LRCDS17R
：
AAATCGAAGCAGCTAACACTGAAGT
；探针
LRCDS17P
：
TTTCGCCATTCTTTGCATCAATCTGCTT。2.
根据权利要求1所述的数字
PCR
定量检测方法，其特征在于：所述数字
PCR
的反应体系如下：
ddPCR master mix for Probes(no dUTP)10
μ
L
，上
、
下游引物各
1.5
μ
L(
终浓度
750nmol/L)
，探针
0.5
μ
L(
终浓度
250nmol/L)
，经
PMA
处理后的样品
DNA
模板5μ
L
，用双蒸水补足总体积
20
μ
L
；所述数字
PCR
的扩增反应条件如下：
95℃
预变性
10min
；
94℃
变性
30s
，
55
～
60℃
退火
1min
，
45
个循环；
98℃
固化微滴

【专利技术属性】
技术研发人员：张奕南，刘洋，赵磊，王越，徐红斌，
申请(专利权)人：上海市质量监督检验技术研究院，
类型：发明
国别省市：