鉴别环颈雉来源的方法技术

本发明专利技术提供了一种鉴别环颈雉来源的方法，其包括如下步骤：提取野生环颈雉和圈养环颈雉不同骨骼肌差异显著的基因位点；针对所述基因位点进行甲基化敏感性高分辨率熔解检测，并验证甲基化位点；设计相应的引物进行

【技术实现步骤摘要】
鉴别环颈雉来源的方法


[0001]本专利技术属于动物检测
，具体涉及一种基于甲基化敏感性高分辨率熔解技术
(MS
‑
HRM)
量化环颈雉骨骼肌
(
胸大肌
、
臂三头肌
、
腓肠肌
、
股二头肌
、
颈升肌
)
差异基因位点的甲基化率，达到鉴别野生和圈养环颈雉的方法
。

技术介绍

[0002]我国拥有世界上规模最大
、
种类最多
、
市场最活跃的野生动物养殖体系，约有
100
多个物种实现了人工养殖和合法利用，包括药用
、
毛皮
、
观赏
、
伴宠等用途
。
但野外种群受到
《
中华人民共和国野生动物保护法
》
和相应地方法规的保护，禁止或限制捕猎和商业化利用
。
因此，一些非法猎捕的野生动物在市场上经常以人工养殖动物的名义售卖，以获得非法利益，逃避法律责任
。
执法实践中有
70
％的案件需要鉴别涉案动物来源于野外还是养殖场
。
但是至今还缺乏直接进行科学鉴定的方法，只能通过“野生动物繁育利用标识”制度所包含的审批手续等间接证明动物来源
。
环颈雉是列入
《
中国畜禽资源目录
》
的食用鸟类，得到大规模饲养，而其野外种群被列为“三有”动物而受到法律的保护，在保护实践中来源鉴定需求较大
。
[0003]肌肉是环颈雉利用的主要部位，而肌肉作为代谢率很高的组织，其蛋白
、
脂肪酸
、
微量元素
、
稳定同位素等组成随环境的更新速度很快，且地域性明显，只能在特定条件下用于动物来源的鉴别
。
因此迫切需要建立一套操作简单
、
高准确率
、
低成本的鉴别肌肉产品来源的方法
。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对现有技术中的不足，目的是提供一种鉴别环颈雉来源的方法
。
[0005]为达到上述目的，本专利技术的解决方案是：
[0006]一种鉴别环颈雉来源的方法，其包括如下步骤：
[0007](1)
提取野生环颈雉和圈养环颈雉不同骨骼肌差异显著的基因位点；
[0008](2)
针对基因位点进行甲基化敏感性高分辨率熔解检测，并验证甲基化位点；
[0009](3)
设计相应的引物进行
PCR
扩增；
[0010](4)
构建不同引物的甲基化率标准曲线，以及样本甲基化
Tm
值得到差异甲基化位点，获得各位点的单点判别力和联合判别力；
[0011](5)
通过野生和圈养之间的差异达到鉴别环颈雉的来源
。
[0012]进一步地，步骤
(1)
中，骨骼肌包括胸大肌
、
臂三头肌
、
腓肠肌
、
股二头肌
、
颈升肌
。
[0013]进一步地，步骤
(2)
中，甲基化位点包括
LOC116231076、LOC116242223、LOC116232884、ATAD2B、EGFL6、HS2ST。
[0014]进一步地，步骤
(3)
中，
LOC116231076
的上游引物序列为
SEQ ID NO.1
，下游引物序列为
SEQ ID NO.2
；
[0015]LOC116242223
的上游引物序列为
SEQ ID NO.3
，下游引物序列为
SEQ ID NO.4
；
[0016]LOC116232884
的上游引物序列为
SEQ ID NO.5
，下游引物序列为
SEQ ID NO.6
；
[0017]ATAD2B
的上游引物序列为
SEQ ID NO.7
，下游引物序列为
SEQ ID NO.8
；
[0018]EGFL6
的上游引物序列为
SEQ ID NO.9
，下游引物序列为
SEQ ID NO.10
；
[0019]HS2ST
的上游引物序列为
SEQ ID NO.11
，下游引物序列为
SEQ ID NO.12。
[0020]进一步地，步骤
(3)
中，
PCR
扩增的条件为：
[0021]预变性阶段：
95℃
预变性
2min
；随后进入循环扩增阶段：
95℃
预变性
10s、
最佳退火温度退火
20s、72℃
延伸
30s
，整个扩增阶段循环
40
次
。
[0022]进一步地，步骤
(5)
中，差异为标准曲线
、
判别力
、
重复性和灵敏度的不同数值
。
[0023]由于采用上述方案，本专利技术的有益效果是：
[0024]本专利技术提供一种利用
MS
‑
HRM
技术定量检测环颈雉不同骨骼肌差异基因位点的甲基化率，即基于
WGBS
下机数据和
MS
‑
HRM
技术所建立的一套筛选甲基化检测位点的方法学流程，通过在野生和圈养两组之间的差异达到鉴别环颈雉来源的方法，可应用于更多动物甲基化差异位点的筛选
。
[0025]本专利技术操作简便
、
通量高
、
成本低
、
耗时少
、
高效且适用范围广
——
采用配有
HRM
分析模块的荧光定量
PCR
仪，一次可以同时检测
90
例样本，通量高，耗时少
。
本专利技术不仅是鉴别野生和圈养环颈雉的方法，也为建立其它动物的同类鉴定方法提供借鉴
。
附图说明
[0026]图1为六个位点甲基化率标准曲线图
(
图
A、B、C、D、E、F
分别为
LOC116231076、LOC116242223、LOC116232884、ATAD2B、EGFL6、HS2ST
的甲基化率标准曲线；
Δ
Tm
为该位点当前甲基化率对应的
Tm
减去甲基化率为
10
％时的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种鉴别环颈雉来源的方法，其特征在于，其包括如下步骤：（1）提取野生环颈雉和圈养环颈雉不同骨骼肌差异显著的基因位点；（2）针对所述基因位点进行甲基化敏感性高分辨率熔解检测，并验证甲基化位点；（3）设计相应的引物进行
PCR
扩增；（4）构建不同引物的甲基化率标准曲线，以及样本甲基化
Tm
值得到差异甲基化位点，获得各位点的单点判别力和联合判别力；（5）通过野生和圈养之间的差异达到鉴别环颈雉的来源
。2.
根据权利要求1所述的鉴别环颈雉来源的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述骨骼肌包括胸大肌
、
臂三头肌
、
腓肠肌
、
股二头肌
、
颈升肌
。3.
根据权利要求1所述的鉴别环颈雉来源的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述甲基化位点包括
LOC116231076、LOC116242223、LOC116232884、ATAD2B、EGFL6、HS2ST。4.
根据权利要求1或3所述的鉴别环颈雉来源的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述
LOC116231076
的上游引物序列为
SEQ ID NO.1
，下游引物序列为
SEQ ID NO.2
；所述
LOC116242223
的上游引物序列为
SEQ ID NO.3
，下游引物序列为
SEQ ID NO.4

【专利技术属性】
技术研发人员：徐艳春，王文慧，张琦，于梦佳，陈晓琳，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：