肠球菌脂磷壁酸合成蛋白多表位抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了肠球菌脂磷壁酸合成蛋白多表位抗原及其制备方法和应用，特点是抗原的氨基酸序列为

【技术实现步骤摘要】
NO.15
所示
。
[0007]2、
上述肠球菌脂磷壁酸合成蛋白多表位重组抗原的制备方法，具体步骤为：步骤一，制备
14
种肠球菌属的脂磷壁酸合成的蛋白多表位抗原序列利用多表位技术设计出
14
种肠球菌属的脂磷壁酸合成的蛋白多表位抗原序列，其氨基酸序列为
SEQ ID NO.15
所示，其中
14
种肠球菌属为粪肠球菌
、
鸡肠球菌
、
棉子糖肠球菌
、
坚忍肠球菌
、
屎肠球菌
、
希拉肠球菌
、
泰国肠球菌
、
酪黄肠球菌
、
鸟肠球菌
、
芒地肠球菌
、
乳酸肠球菌
、
孤立肠球菌
、
假鸟肠球和恶臭肠球菌；步骤二，将步骤一得到的蛋白多表位抗原序列转换成脂磷壁酸合成的蛋白基因
(En dltD)
序列，合成
En dltD
基因后克隆到
>pET
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种肠球菌脂磷壁酸合成蛋白多表位抗原，其特征在于：该抗原的氨基酸序列为
SEQ ID NO.15
所示
。2.
如权利要求1所述的肠球菌脂磷壁酸合成蛋白多表位重组抗原的制备方法，其特征在于具体步骤为：步骤一，制备
14
种肠球菌属的脂磷壁酸合成的蛋白多表位抗原序列利用多表位技术设计出
14
种肠球菌属的脂磷壁酸合成的蛋白多表位抗原序列，其氨基酸序列为
SEQ ID NO.15
所示，其中
14
种肠球菌属为粪肠球菌
、
鸡肠球菌
、
棉子糖肠球菌
、
坚忍肠球菌
、
屎肠球菌
、
希拉肠球菌
、
泰国肠球菌
、
酪黄肠球菌
、
鸟肠球菌
、
芒地肠球菌
、
乳酸肠球菌
、
孤立肠球菌
、
假鸟肠球和恶臭肠球菌；步骤二，将步骤一得到的蛋白多表位抗原序列转换成脂磷壁酸合成的蛋白基因（
En dltD
）序列，合成
En dltD
基因后克隆到
pET
‑
28a
（
+
）载体上，将含有
En dltD
基因的质粒转化至蛋白表达型感受态细胞
BL21
（
DE3
）中，筛选出阳性克隆并进行蛋白表达，利用亲和层析法进行蛋白纯化得到肠球菌脂磷壁酸合成蛋白多表位重组抗原
。3.
根据权利要求2所述的肠球菌脂磷壁酸合成蛋白多表位重组抗原的制备方法，其特征在于步骤二具体为：将步骤一得到的蛋白多表位抗原序列转换成脂磷壁酸合成的蛋白基因序列，合成
En dltD
基因后克隆到
pET
‑
28a
（
+
）载体上，将含有
En dltD
基因的质粒转化至蛋白表达型感受态细胞
BL21
（
DE3
）中，在
37 ℃、110 r/min
条件下培养至菌液
OD
600
为
0.4
‑
0.6
时，加入终浓度为
0.5 mM
的
IPTG 16 ℃
低温诱导
12 h
，促进多表位抗原
dltD
的大量表达；诱导结束后，以
10000 r/min
的转速离心
5min
，弃掉液体培养基，菌体用
10
倍缓冲溶液重悬后，用纳米高压均质机，于
55
‑
65 MPa
的压力低温破碎，于
4 ℃
，
10000 r/min
离心
20 min
，将上清液倒入镍柱1‑
2h
后，用含有
70 mM
咪唑冲洗杂蛋白至蛋白峰降至平稳后，更换
500 mM
咪唑收集含多表位抗原
dltD
蛋白溶液的洗脱液，得到肠球菌脂磷壁酸合成蛋白多表位重组抗原，其中缓冲溶液配方为
25mM Tris
，
150 mM NaCl
，
pH=8.0。4.
一种权利要求2制备方法得到的肠球菌脂磷壁酸合成蛋白多表位重组抗原在制备多表位抗体方面的应用，其特征在于多表位抗体制备方法具体步骤如下：将肠球菌脂磷壁酸合成蛋白多表位重组抗原分别与弗氏完全佐剂和不完全佐剂混匀，采用腹腔注射的方式对小鼠进行免疫，免疫4次后进行取血，获得免疫小鼠血清，即得到多表位抗体
。5.
一种利用权利要求4制备方法得到的多表位抗体检测待测样品液中肠球菌含量的方法，其特征在于以多表位抗体作为标记蛋白，利用微量...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏秀榕，刘岩，张真，周君，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：