灭活形式的甲型流感病毒在制备核酸标准物质中的应用制造技术

本发明专利技术公开了灭活形式的甲型流感病毒在制备核酸标准物质中的应用

【技术实现步骤摘要】
灭活形式的甲型流感病毒在制备核酸标准物质中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及灭活形式的甲型流感病毒在制备核酸标准物质中的应用
。

技术介绍

[0002]病毒
、
细菌
、
支原体
、
真菌等病原微生物是临床常见呼吸道感染源，可通过接触
、
飞沫和气溶胶传播
。
随着分子生物学技术的发展和核酸检测技术的普及，核酸检测已广泛应用于呼吸道病原微生物快速检测，多种呼吸道病原微生物核酸检测试剂盒被设计开发和应用，实现对患者的快速精准诊断
。
[0003]核酸标准物质可以保证核酸检测结果的可靠与一致，可以实现核酸检测的计量溯源与质量控制
。
现有的核酸标准物质多为体外制备核酸片段
(DNA
或
RNA
片段
)、
提取基因组核酸或包含部分片段的假病毒等形式，各种形式的标准物质都各有利弊，体外制备的核酸分子，一般纯度较高，定值可靠，但是容易受核酸酶
(RNase)
降解，稳定性差，且体外制备核酸分子结构简单，与病毒粒子不同，无须经过病毒裂解
、
核酸释放的过程，不能对核酸提取过程进行质控；假病毒形式的标准物质具有蛋白质外壳结构，内含特异性病毒
RNA
，在形态和结构上与天然病毒粒子相似，但是假病毒形式的标准物质一般只能包装较短的核酸片段，无法包含病毒的全基因组序列核酸，无法包含试剂盒的所有检测靶点r/>。
同时，现有的核酸标准物质研发多集中于新型冠状病毒核酸检测领域，其他的呼吸道传播病原微生物诊断方法缺乏有证标准物质，无法保证相关检测结果的量值溯源
。
[0004]综上所述，现有核酸标准物质与实际病原体差距较大，不能实现所有方法检测靶标的覆盖，或不能实现检测方法全过程质控，不适应现有检测技术的发展，现有的商品化呼吸道病原微生物核酸检测试剂盒中，作为阳性对照的质控品多由各厂家自行制备提供，缺乏统一的质量控制和量值标定，不具备公正
、
可靠的计量溯源功能，因此，急需研制开发与病原体高度接近核酸标准物质
。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供灭活形式的甲型流感病毒在制备核酸标准物质中的应用，以期解决现有的核酸标准物质不能涵盖样品提取环节或不能包括病原体全基因组核酸等问题
。
[0006]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，灭活形式的甲型流感病毒
Influenza A virus(H1N1)ATCC VR
‑
825
在制备核酸标准物质中的应用
。
[0008]本专利技术中，为填补现有技术空白，本专利技术针对甲型流感病毒
H1N1
型病毒，研制了灭活病毒形式的标准物质，通过病毒培养与浓缩
、
病毒灭活方法研究
、
病毒灭活效果验证
、
核酸提取方法研究
、
定值方法建立与优化
、
均匀性检验
、
稳定性监测等研究，确保标准物质的生物安全性
、
适用性及量值准确性，大大提升标准物质的实用性，并在多家试剂盒生产企业
开展应用验证，为相关呼吸道病原微生物核酸检测市场监管提供计量技术保障
。
[0009]优选地，所述标准物质中灭活形式的甲型流感病毒
Influenza A virus(H1N1)ATCC VR
‑
825
的浓度为
1000
～
2000
拷贝数
(copies)/
μ
L。
[0010]第二方面，本专利技术提供一种核酸标准物质的制备方法，所述方法包括：
[0011]制备甲型流感病毒
Influenza A virus(H1N1)ATCC VR
‑
825
的病毒液，对所述病毒液进行灭活处理，即得到所述核酸标准物质
。
[0012]优选地，所述病毒液的制备方法包括：
[0013]对甲型流感病毒
Influenza Avirus(H1N1)ATCC VR
‑
825
进行传代培养，收集上清，去除细胞和细胞碎片，得到病毒液
。
[0014]优选地，所述传代培养使用的宿主细胞包括
MDCK
细胞
。
[0015]优选地，所述传代培养的培养基为
EMEM
培养基
(1
％双抗，1μ
g/mL TPCK)。
[0016]优选地，所述灭活处理包括：
[0017]将所述病毒液与
β
‑
丙内酯混合，进行灭活反应
。
[0018]优选地，所述灭活反应的温度为
18
～
25℃
，包括但不限于
19℃、20℃、21℃、22、23℃
或
24℃
等，时间为
18
～
24h
，包括但不限于
19h、20h、21h、22h
或
23h
等
。
[0019]优选地，所述
β
‑
丙内酯的工作浓度为
0.05
％～
0.15
％，包括但不限于
0.08
％
、0.1
％
、0.12
％
、0.13
％或
0.14
％等
。
[0020]第三方面，本专利技术提供一种第一方面所述的核酸标准物质的定值方法，所述方法包括：
[0021]以第一方面所述的核酸标准物质中核酸为模板，与引物和探针及扩增试剂混合，进行数字
PCR
，根据数字
PCR
结果计算灭活形式的甲型流感病毒
Influenza A virus(H1N1)ATCC VR
‑
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的浓度
。
[0022]优选地，所述引物的核酸序列包括
SEQ ID NO.1
和
SEQ ID NO.2
所示的序列
。
[0023]优选地，所述探针的核酸序列包括
SEQ ID NO.3
所示的序列
。
[0024]SEQ ID NO.1
：
GACCAATCCTGTCACCTCTGAC。
[0025]SEQ ID NO.2
：
AGAGCATTTTGGACAAAGCGTCTA。
[0026]SEQ ID NO.3
：
TGCAGTCCCCGCTC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
灭活形式的甲型流感病毒
InfluenzaA virus(H1N1)ATCC VR
‑
825
在制备核酸标准物质中的应用
。2.
根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核酸标准物质中灭活形式的甲型流感病毒
Influenza A virus(H1N1)ATCC VR
‑
825
的浓度为
1000
～
2000
拷贝数
/
μ
L。3.
一种核酸标准物质的制备方法，其特征在于，所述方法包括：制备甲型流感病毒
Influenza A virus(H1N1)ATCC VR
‑
825
的病毒液，对所述病毒液进行灭活处理，即得到所述核酸标准物质
。4.
根据权利要求3所述的核酸标准物质的制备方法，其特征在于，所述病毒液的制备方法包括：对甲型流感病毒
Influenza A virus(H1N1)ATCC VR
‑
825
进行传代培养，收集上清，去除细胞和细胞碎片，得到病毒液；优选地，所述传代培养使用的宿主细胞包括
MDCK
细胞
。5.
根据权利要求3或4所述的核酸标准物质的制备方法，其特征在于，所述灭活处理包括：将所述病毒液与
β
‑
丙内酯混合，进行灭活反应；优选地，所述灭活反应的温度为
18
～
25℃
，时间为
18
～
24h
...

【专利技术属性】
技术研发人员：许丽，乐丽欢，刘刚，胡轶红，杨雪，李兰英，闻艳丽，王炤坤，陶晴，
申请(专利权)人：中国科学院上海免疫与感染研究所，
类型：发明
国别省市：