一种大肠杆菌包涵体复性的方法技术

本发明专利技术涉及涉及的是生物工程下游蛋白质纯化领域，具体涉及大肠杆菌蛋白表达形成包涵体的复性方法，其特征在于具体的工艺步骤如下：（１）包涵体蛋白的收集，４℃?５０００ｒｐｍ／ｍｉｎ?６ｍｉｎ离心收集菌体，将菌体超声破碎，４℃?８０００ｒｐｍ／ｍｉｎ?３０ｍｉｎ高速冷冻离心得到Ｐ００３Ｂ蛋白包涵体；（２）包涵体的纯化，重悬包涵体于５０ｍＬ洗涤缓冲液，溶解杂蛋白及其他杂质从而纯化Ｐ００３Ｂ包涵体；（３）包涵体复性，在４℃，溶解的包涵体通过恒流泵，用复性缓冲液，缓慢稀释至缓冲液ｐＨ为８．０，并不断搅拌，本发明专利技术与现有技术相比，温和溶解方法保留了在包涵体形成过程中形成的蛋白质二级结构，提高了包涵体复性的效率，简化了复性的步骤，节约了时间，从而大大降低了重组蛋白生产的费用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及涉及的是生物工程下游蛋白质纯化领域，具体涉及大肠杆菌蛋白表达 形成包涵体的复性方法。
技术介绍
大肠杆菌被广泛用来表达那些不需要翻译后修饰如糖基化维持活性的蛋白质，然 而大肠杆菌大量表达重组蛋白质常常导致其聚集并形成蛋白沉淀——包涵体。包涵体蛋白 没有生物活性，需要复杂的溶解，复性，纯化来得到有功能活性的产品。通常，要用高浓度的 变性剂(尿素，盐酸胍)溶解包涵体，同时加入还原剂如β-巯基乙醇，蛋白溶解后，在存在 氧化剂的条件下通过缓慢去掉变性剂的方法来复性。传统的包涵体复性方法的缺点(1)用高浓度变性剂溶解包涵体将导致蛋白质二 级结构丧失，这样将使肽链随机缠绕并使疏水表面暴露，而包涵体复性出有生物活性的蛋 白质效率低的主要原因是在溶解时失去了蛋白质二级结构，在复性的过程中变性的蛋白质 相互缠绕聚集沉淀。(2)在很多时候，包涵体复性的回收率大概为15-25%，其占有大肠杆 菌生产重组蛋白的绝大部分费用。因此，生物工程的一个很大挑战就是将这种没有活性和 不可溶的蛋白更有效的转化为可溶和正确折叠的蛋白质。因此，如果能找到一种溶解的方 法使包涵体溶解但又不使其二级结构丧失，这本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠杆菌包涵体复性的方法，其特征在于具体的工艺步骤如下：（１）弃去上清重悬沉淀于１００ｍＬ包涵体溶解缓冲液，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，５００ｍＭＮａＣｌ，２Ｍ　Ｕｒｅａ，１ｍＭ　ＰＭＳＦ　ｐＨ　８．０；（２）将重悬的包涵体分成１０份，分别调节包涵体溶解缓冲液ｐＨ到３．０，４．０，５．，０，６．０，７．０，８．０，９．０，１０．０，１１．０，１２．０；（３）分别超声溶解，４００瓦，工作１秒，间息１秒，总时长１分钟；（４）分别４℃８０００ｒｐｍ／ｍｉｎ　３０ｍｉｎ高速冷冻离心；（５）分别取各不同ｐＨ值超声溶解液上清２０ｕｌ进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，观察哪个酸碱度下包涵体溶解的量大，即筛选出包涵体温和...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王志超，
申请(专利权)人：上海瑞基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]