金属纳米簇合成方法及其在转基因Bt蛋白检测中的应用技术

本发明专利技术涉及食品安全免疫检测技术领域，具体涉及一种金属纳米簇合成方法及其在转基因Bt蛋白检测中的应用；本发明专利技术提供的纳米簇金属材料可精确应用于转基因蛋白Bt蛋白融合基因Cry1Ab/Ac的快速检测，具有以下特有优势：测定灵敏度高，检测限低、测定时间短；通过把酶固定在纳米金属簇材料上，能够保证酶的活性和稳定性，实现高效固定酶分子以实现信号放大，并建立Cry1Ab浓度与吸光度之间的定量检测关系，实现对Bt蛋白的高效定量检测。现对Bt蛋白的高效定量检测。现对Bt蛋白的高效定量检测。

【技术实现步骤摘要】
金属纳米簇合成方法及其在转基因Bt蛋白检测中的应用


[0001]本专利技术涉及食品安全免疫检测
，尤其涉及一种金属纳米簇合成方法及其在转基因Bt蛋白检测中的应用。

技术介绍

[0002]随着基因工程技术的不断发展，转基因作物的种植面积逐年扩大，其安全性成为人们关注的焦点。尽管我国对转基因作物及产品已经实施了强制性的标识条例，但仍有许多非法种植，销售转基因作物的案例发生。因此，开发一种简单，快速，高灵敏的转基因作物鉴定方法，对转基因产品的监管和安全评价变得尤为重要。金属纳米簇纳米材料，合成方法简单，反应条件温和，同时实现材料合成与酶的固定。该材料因为其特殊的合成化过程和材料性质，在负载酶方面具有广泛的应用。在转基因作物培育过程中，苏云金芽孢杆菌(Btillusthuringiensis，Bt)是一种天然的土壤细菌，也是一种普遍存在的革兰氏阳性及好氧杆状细菌，在其生长周期的稳定过程中，可以产生对某些特定昆虫具有杀虫功能的活性蛋白，传统的ELISA检测Bt蛋白方法中，一个酶分子通常只结合一个分子的分析物，限制了其检测灵敏度的提高。由于在一个纳米颗粒上可以同时固定多个酶分子，因此纳米材料可以作为酶的载体来实现信号放大。虽然酶的固定比较牢固，但是步骤繁琐，试剂繁多而且还会造成一定的酶活力损失。这些问题都会给检测结果带来不确定性。所以，酶的固定化问题是纳米材料应用于酶标分析的核心问题。
[0003]为了实现一种简单而又高效的酶的固定方法，调控纳米材料的表面结构和性质是需要解决的关键问题。金属纳米材料中，纳米簇因其表面积大，热和稳定性好，易于官能化以及良好的生物相容性而被最广泛地用于固定化酶。同时，由于其独特的光学和催化特性，稳定性和表面功能性。目前纳米簇纳米材料已被广泛用于生物传感和分析应用。基于上述问题，本专利技术旨在提供一种金属纳米簇合成方法及其在转基因Bt蛋白检测中的应用，以解决上述技术问题，实现转基因蛋白Bt蛋白简单、快速、低成本的检测方法目的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种金属纳米簇合成方法及其在转基因Bt蛋白检测中的应用，实现转基因蛋白Bt蛋白简单、快速、低成本的检测方法目的。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用的一种金属纳米簇合成方法，包括如下步骤：
[0006]取氯金酸溶于去离子水中，得氯金酸溶液；
[0007]取氯化钯溶于去离子水中，得氯化钯溶液；
[0008]取聚乙烯醇溶于去离子水中，得聚乙烯醇溶液；
[0009]取硼氢化钠溶于去离子水中，得硼氢化钠溶液；
[0010]将1.7mL氯金酸溶液、1.7mL氯化钯溶液和4mL聚乙烯醇溶液加入水稀释搅拌，得到混合液；
[0011]将硼氢化钠溶液溶液中加入混合液中，静置反应，得到胶体；
[0012]将1g二氧化硅加入胶体中，搅拌得到Au
‑
Pd/SiO2，将所得到的Au
‑
Pd/SiO2纳米材料重新分散在1mLPBS缓冲溶液中，得到Au
‑
Pd/SiO2/PBS缓冲溶液；
[0013]在Au
‑
Pd/SiO2/PBS缓冲溶液中，加入BCSA，混合均匀，振荡反应之后，用水离心洗涤，将洗涤后的BCSA/Au
‑
Pd/SiO2纳米材料重新分散在1mLPBS缓冲溶液中，稀释得到BCSA/Au
‑
Pd/SiO2缓冲溶液；
[0014]将碳酸盐缓冲溶液加入到0.1mg/mL鼠单克隆抗体溶液中，稀释100倍，加入到96酶标孔板，100μL/孔，在5℃的温度下孵育过夜，得到抗体溶液A；
[0015]用500μLPBST/孔振荡洗涤抗体溶液A后，加入500μL1％BSA封闭液，100μL/孔，孵育得到抗体溶液B；
[0016]取PBST洗涤抗体溶液B后，加入不同浓度的Bt蛋白Cry1Ab，100μL/孔，孵育得到Bt蛋白检测溶液；
[0017]将0.1mg/mL兔多克隆抗体稀释500倍，加入Bt蛋白检测溶液，100μL/孔，孵育得到标记反应溶液A；
[0018]将BCSA/Au
‑
Pd/SiO2缓冲溶液加入至标记反应溶液A，100μL/孔，加入底物显色剂TMB溶液，100μL/孔，孵育得到标记反应溶液B；
[0019]在标记反应溶液B中加入H2SO4溶液，利用多功能酶标仪，检测每个孔的光密度。
[0020]其中，在取氯化钯溶于去离子水中，得氯化钯溶液的步骤中：
[0021]氯化钯溶液溶液中的Pd
2+
离子浓度为0.01～0.1mol/L。
[0022]其中，在取聚乙烯醇溶于去离子水中，得聚乙烯醇溶液的步骤中：
[0023]聚乙烯醇溶液PVA的浓度为0～50mg/mL。
[0024]其中，在将1.7mL氯金酸溶液、1.7mL氯化钯溶液和4mL聚乙烯醇溶液加入水稀释搅拌，得到混合液的步骤中：
[0025]水的体积为0～100mL，搅拌温度0～50℃，时间为0～10h。
[0026]其中，在将硼氢化钠溶液溶液中加入混合液中，静置反应，得到胶体的步骤中：
[0027]反应温度0～50℃，反应时间为0～10h，硼氢化钠溶液体积为0～100mL。
[0028]其中，在Au
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Pd/SiO2/PBS缓冲溶液中，加入BCSA，混合均匀，振荡反应之后，用水离心洗涤，将洗涤后的BCSA/Au
‑
Pd/SiO2纳米材料重新分散在1mLPBS缓冲溶液中，稀释得到BCSA/Au
‑
Pd/SiO2缓冲溶液的步骤中：
[0029]稀释倍数为0～30倍。
[0030]其中，在用500μLPBST/孔振荡洗涤抗体溶液A后，加入500μL1％BSA封闭液，100μL/孔，孵育得到抗体溶液B的步骤中：
[0031]PBST的pH为0～10。
[0032]其中，在取PBST洗涤抗体溶液B后，加入不同浓度的Bt蛋白Cry1Ab，100μL/孔，孵育得到Bt蛋白检测溶液的步骤中：
[0033]Bt蛋白Cry1Ab的浓度包括0、0.8、1.6、3.4、5.0、11.0ng/mL。
[0034]其中，在标记反应溶液B中加入H2SO4溶液，利用多功能酶标仪，检测每个孔的光密度的步骤中：
[0035]H2SO4溶液的浓度为0～5mol/L，检测波长为300～600nm。
[0036]本专利技术还提供所述金属纳米簇合成方法在转基因蛋白Bt蛋白融合基因cry1Ab/Ac
检测的应用。
[0037]本专利技术的一种金属纳米簇合成方法及其在转基因Bt蛋白检测中的应用，通过取氯金酸溶于去离子水中，得氯金酸溶液；取氯化钯溶于去离子水中，得氯化钯溶液；取聚乙烯醇溶于去离子水中，得聚乙烯醇溶液；取硼氢化钠溶于去离子水中，得硼氢化钠溶液；将1.7mL氯金酸溶液、1.7mL氯化钯溶液和4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种金属纳米簇合成方法，其特征在于，包括如下步骤：取氯金酸溶于去离子水中，得氯金酸溶液；取氯化钯溶于去离子水中，得氯化钯溶液；取聚乙烯醇溶于去离子水中，得聚乙烯醇溶液；取硼氢化钠溶于去离子水中，得硼氢化钠溶液；将1.7mL氯金酸溶液、1.7mL氯化钯溶液和4mL聚乙烯醇溶液加入水稀释搅拌，得到混合液；将硼氢化钠溶液溶液中加入混合液中，静置反应，得到胶体；将1g二氧化硅加入胶体中，搅拌得到Au
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Pd/SiO2，将所得到的Au
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Pd/SiO2纳米材料重新分散在1mLPBS缓冲溶液中，得到Au
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Pd/SiO2/PBS缓冲溶液；在Au
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Pd/SiO2/PBS缓冲溶液中，加入BCSA，混合均匀，振荡反应之后，用水离心洗涤，将洗涤后的BCSA/Au
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Pd/SiO2纳米材料重新分散在1mLPBS缓冲溶液中，稀释得到BCSA/Au
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Pd/SiO2缓冲溶液；将碳酸盐缓冲溶液加入到0.1mg/mL鼠单克隆抗体溶液中，稀释100倍，加入到96酶标孔板，100μL/孔，在5℃的温度下孵育过夜，得到抗体溶液A；用500μLPBST/孔振荡洗涤抗体溶液A后，加入500μL1％BSA封闭液，100μL/孔，孵育得到抗体溶液B；取PBST洗涤抗体溶液B后，加入不同浓度的Bt蛋白Cry1Ab，100μL/孔，孵育得到Bt蛋白检测溶液；将0.1mg/mL兔多克隆抗体稀释500倍，加入Bt蛋白检测溶液，100μL/孔，孵育得到标记反应溶液A；将BCSA/Au
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Pd/SiO2缓冲溶液加入至标记反应溶液A，100μL/孔，加入底物显色剂TMB溶液，100μL/孔，孵育得到标记反应溶液B；在标记反应溶液B中加入H2SO4溶液，利用多功能酶标仪，检测每个孔的光密度。2.如权利要求1所述的金属纳米簇合成方法，其特征在于，在取氯化钯溶于去离子水中，得氯化钯溶液的步骤中：氯化钯溶液溶液中的Pd
2+
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【专利技术属性】
技术研发人员：王锐，高鸿飞，王坚，赵丽霞，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：