用于评估血液参数的方法技术

技术编号:39583280 阅读:5 留言:0更新日期:2023-12-03 19:32
本发明专利技术涉及一种评估与血液凝固过程相关的血栓性和出血性疾病风险的方法

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于评估血液参数的方法


[0001]本专利技术的目的是用于评估与血液凝固过程相关的血栓性和出血性疾病,例如血友病或血栓形成的风险以及用于监测药物治疗的方法


技术介绍

[0002]血液凝固是一个复杂的

多因素的生理过程,其允许身体对血栓形成刺激
(
例如,血管损伤
)
做出反应

凝血过程是一种生理机制,其导致受损血管的修复,并且对于在任何性质的血管损伤的情况下避免出血是必不可少的

[0003]凝血包括血管和血小板阶段
(
初级止血
)
和凝血阶段
(
次级止血
)。
[0004]在血管损伤处形成止血凝块是一个生理过程

在健康个体中,它通过血小板的粘附和聚集能力
(
初级止血
)
发生,其激活导致聚集体的形成,该聚集体由于纤维蛋白的形成
(
次级止血
)
,然后形成止血塞,该止血塞能够阻止血液从损伤本身流出

[0005]如果血液凝固是“过度”意义上的异常,则出现血栓性疾病,如果是“不足”的,则出现出血性疾病

[0006]血栓形成是一种病理过程,包括一种或多种称为血栓的血凝块的非生理性形成,血栓由纤维蛋白

血小板

红细胞和白细胞组成

当由于凝血过程的异常或由于外部因素
(
例如减少血管腔体的胆固醇斑块的存在
)
,血栓阻碍或限制了对相关器官的正常血液供应时,患者处于急性现象的危险中,例如血栓形成

心肌梗塞

缺血性中风

肺栓塞

在血栓性疾病中,我们首先提及所有属于心血管疾病
(CVD)
的慢性或急性疾病

[0007]相反,在出血性疾病中,凝血过程的改变是无效的,并导致出血事件的出现

例如,因子缺乏症
(factorial deficits)、
血管性血友病
(Von Willebrand

s disease)、
血友病等就是这种情况

[0008]多年来,一些技术限制阻止了对患有止血病症的个体的凝血缺陷的诊断

类似地,很难确定这些缺陷如何与它们与之协同作用的类似的血栓形成病症相关,从而导致严重的生理病理功能障碍

[0009]一个相关的问题在于,所述病理表现因为它们是无症状的而难以诊断,或者也存在于正常生活中从未表现出病理事件,并且在“创伤性”事件
(
例如手术
)
的情况下会出现严重的出血或血栓性缺血表现的受试者中

[0010]另一个相关的问题是监测抗血小板或抗凝药物治疗,以便能够评估这种治疗随时间的效力

[0011]因此,在临床环境中,需要一种“离体”功能检测,其能够识别潜在的血栓形成或出血风险

[0012]目前用于血液凝固功能障碍的诊断分析的方法可分为三类:
i)
仅评估血小板整体功能的方法,
ii)
仅定义血液中血浆成分特征的方法,
iii)
使用全血评估整体凝血而不区分血小板功能和纤维蛋白成分的方法

[0013]目前关于血小板功能的信息是通过聚集测试获得的,而血浆成分的功能是通过测
定凝血酶原时间
(PT)
和部分凝血活酶时间
(aPTT)
来确定的,其分别分析血液凝固的外在和内在凝血级联

[0014]临床实践中通常考虑两种级联反应,因为两者都涉及因子
X(
第十
)
,因子
X
介导凝血酶原转化为凝血酶,凝血酶是负责纤维蛋白原转化为纤维蛋白的最终因子

然而,对这两种级联反应的分析不能让我们理解,例如,为什么患有因子
XII
先天性缺陷的患者在凝血方面没有改变,而因子
IX
活性的缺陷却定义了一个特别关键的临床表现

[0015]从欧洲专利申请
06819957.9
和以
WO 2013/124727
号公布的国际申请中已知凝结现象的“离体”动态评估方法,这两个申请均在本专利技术申请人名下

这些专利申请描述了用于动态确定患者血液样品中血小板聚集体形成的方法和设备

[0016]本专利技术源于这样的考虑,即同时在生理和病理条件下,血栓形成是由血小板

血浆成分和受损血管壁之间的流动相互作用引发的

[0017]粘附

活化和血小板聚集的结合,以及内皮下层中存在的细胞外基质
(ECM)
的成分和由内皮下层组织因子的暴露在血管损伤部位引发的伴随的凝固过程,导致纤维蛋白的形成,其稳定血小板血栓

[0018]因此,本专利申请的专利技术人已经得出结论,“离体”临床测定方法必须涉及多因素过程的动态和非静态分析,并且必须考虑调节血小板聚集和粘附以及凝血酶生成和纤维蛋白形成的主要细胞和分子机制


技术实现思路

[0019]因此,本专利技术涉及一种对受试者血液样品中的凝结过程进行“离体”动态评估的方法,如所附权利要求书中所概述的,其出于说明充分性的目的,形成了本说明书的组成部分

[0020]本专利技术进一步的特征和优点将通过以下对其优选实施方案的描述变得显而易见,这些优选实施方案是通过示意性和非限制性的实例给出的

附图说明
[0021]图1描绘了根据本专利技术的设备的局部透视图,并且放大了所述设备的一些细节;
[0022]图2描绘了本专利技术设备的第一细节的前视图;
[0023]图3描绘了本专利技术设备的第二细节的透视图;
[0024]图4描绘了分析灌流器
(cartridge)
的透明透视图;
[0025]图5描绘了图4的灌流器的纵向剖视图;
[0026]图6描绘了图4的灌流器的俯视平面图;
[0027]图7描绘了图4的灌流器的灌注室的实施方案的俯视平面图;
[0028]图8描绘了图4的灌流器的灌注室的实施方案的示意性平面图;
[0029]图9描绘了可移动支撑构件的不同实施方案的示意性平面图;
[0030]图
10
描绘了本专利技术的灌流器的不同实施方案的示意性平面图;
[0031]图
11
描绘了本专利技术的灌流器的另一不同实施方案的示意性平面图;
[0032]图
12
描绘了用本文档来自技高网
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种用于分析受试者血液样品的凝血功能的离体方法,包括以下步骤:
a)
提供取自受试者并添加了抗凝血物质的全血样品;
b)
用溶液处理步骤
a)
的血液样品,所述溶液由用于标记血小板和用于标记纤维蛋白的荧光探针和血液样品的再钙化溶液组成,所述荧光探针能够或多或少地特异性结合血小板和纤维蛋白并以两种不同的发射频率发射荧光,其中上述两种溶液是单独的或在单一试剂中组合;
c)
将所述再钙化的血液样品引入具有至少一个灌注室的分析装置,其中至少一个壁由包含细胞粘附物质的透明材料组成,使所述血液样品在已知和可测量的流动条件下流入灌注室;
d)
在血液在灌注室中流动期间,交替采集至少两个系列的荧光图像,使得至少一个系列的荧光图像在血小板的荧光探针的发射波长特征下采集,并且至少一个其他系列的荧光图像在纤维蛋白的荧光探针的另一发射波长特征下采集;
e)
对血小板和纤维蛋白的采集图像的像素进行二值化,从而产生用于血小板聚集体形成的被照亮像素覆盖的面积对时间
(t)
的第一曲线和用于纤维蛋白形成的被照亮像素覆盖的面积对时间的第二曲线;所述方法包括选自以下的至少一个步骤:
f)
生成血小板聚集体形成的平均荧光强度对时间的第一曲线和纤维蛋白形成的平均荧光强度对时间的第二曲线;
g)
生成定义为血小板聚集形成的面积和荧光强度的乘积相对于时间的第一积分密度曲线和定义为纤维蛋白形成的面积和荧光强度的乘积相对于时间的第二积分密度曲线;
h)
生成粒子数对时间的曲线,其中所述粒子数通过由多于2个被照亮像素组成的血小板聚集体的数量给出;
i)
生成粒子尺寸对时间的曲线,其中所述粒子尺寸通过由多于2个被照亮像素组成的血小板聚集体的平均尺寸给出;
j)
生成最大斜率的值,该值被定义为针对在步骤
e)、f)、g)、h)

i)
的一个或多个步骤中获得的参数的曲线计算的一阶导数函数的相对最大点;
k)
生成最大加速度的值,该值被定义为针对在步骤
e)、f)、g)、h)

i)
的一个或多个步骤中获得的参数的曲线计算的二阶导数函数的相对最大点;
l)
生成
F/P
比值,其被定义为在一个或多个步骤
e)、f)

g)
中获得的参数的纤维蛋白
AUC
与血小板
AUC
的比值;其中所述方法进一步包括以下步骤
:m)
生成代表纤维蛋白形成时间的滞后时间值,其被定义为对应于第一次出现五幅连续图像的时间,其中与纤维蛋白相关的测量面积值
>
曲线最大峰值的1%;
n)
生成由在步骤
e)、f)、g)、h)

i)
的一个或多个步骤中获得的参数的曲线下面积给出的
AUC(
曲线下面积
)

。2.
根据权利要求1所述的方法,其中,所述分析装置包括参考标记,所述参考标记被配置为识别其上将发生血小板和纤维蛋白的粘附现象的表面所处的高度
。3.
根据权利要求1或2所述的方法,其中所述抗凝血物质是肝素或柠檬酸盐
。4.
根据权利要求
1、2
或3所述的方法,其中步骤
b)
中使用的荧光探针是:

用于标记血小板,具有约
488 nm
的激发波长和约
510 nm
的发射波长的奎纳克林探针,或抗血小板抗体或其衍生物
(
例如
Fab
,抗原结合片段
)
,其与具有约
495 nm
的激发波长和约
519 nm
的发射波长的荧光分子缀合,例如
ALEXA488


用于标记纤维蛋白,抗纤维蛋白抗体,其与具有约
556 nm
的激发波长和约
573 nm
的发射波长的荧光分子缀合,例如
ALEXA546。5.
根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述血液样品的再钙化通过添加一定量的钙盐,优选氯化钙来进行
。6.
根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述灌注室包括至少一个微通道部分,所述微通道部分被配置为获得
150

‑1至
500

‑1、
优选约
300

‑1的剪切速率以模拟静脉血管中的生理条件,以及至少一个微通道部分,所述微通道部分被配置为获得
1000

‑1至
2000

‑1、
优选约
1500

‑1的剪切速率以模拟动脉血管中的生理条件
。7.
根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述灌注室在其表面或其部分上包括至少一种细胞粘附物质,所述至少一种细胞粘附物质选自
I
型纤维状胶原蛋白
、I/III
型胶原蛋白
、VI
型胶原蛋白
、PG

M/
多能蛋白聚糖
(
血管
)、
基膜蛋白多糖纤连蛋白

层粘连蛋白

1、
玻连蛋白

核心蛋白聚糖

双糖链蛋白聚糖
、Fibulin

1、
肌腱蛋白

C、
光蛋白聚糖

血小板反应蛋白

...

【专利技术属性】
技术研发人员:扎韦里奥
申请(专利权)人:赛蒂奇道蒂奇公司
类型:发明
国别省市:

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