双特异性抗体与NK细胞联合在治疗疾病中的应用制造技术

本发明专利技术提供了双特异性抗体与NK细胞联合在治疗疾病中的应用，所述所述的双特异性抗体包括靶向CD16抗原结合域和靶向CD19抗原结合域，既能够靶向识别肿瘤细胞，又能够有效激活和募集NK细胞，强化肿瘤免疫功能；进一步，双特异性抗体采用增强型结构，含有两个2个靶向CD16抗原结合域和2个靶向CD19抗原结合域，靶向CD16抗原结合域和靶向CD19抗原结合域分别位于Fc片段两侧，且相同抗原结合域位于同侧，这样可以防止不同类型抗原结合域之间的相互干扰，提高和保持与目标抗原的亲和能力；进一步，所述双特异性抗体和异体来源的NK细胞构成药物组合物，可避免肿瘤患者体内肿瘤微环境对自体免疫细胞的干扰，发挥强烈的肿瘤抑制作用。本发明专利技术所述双特异性抗体及其药物组合物，能够有效抑制白血病、淋巴瘤和骨髓瘤细胞增殖，调节免疫因子表达，强化机体免疫反应对抗肿瘤侵袭。肿瘤侵袭。

【技术实现步骤摘要】
双特异性抗体与NK细胞联合在治疗疾病中的应用

：
[0001]本专利技术属于药物研究领域，具体提供了一种双特异性抗体与NK细胞联合在治疗疾病中的应用。

技术介绍
：
[0002]肿瘤是严重影响人类健康的疾病，尽管诸如手术、化学药物、放射治疗等治疗手段虽然日趋成熟，但是仍面临很多临床困难，如复发率高，5年存活率难以进一步改善，出现令人厌烦的严重不良反应影响患者生活质量等等。近年来，随着对于人体自身免疫调节机制的研究和认识不断深入，肿瘤免疫疗法逐渐崭露头角，并且受到越来越多的重视，以免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体为代表的新一代治疗技术在肿瘤临床应用中取得了令人惊奇的治疗效果，催生了很多明星药物，这提示出肿瘤免疫治疗成为了新型抗肿瘤药物的重要开发方向。
[0003]迄今为止，大多数免疫调节治疗方法都集中在增强T细胞反应上，如嵌合抗原受体(CAR)T细胞。CAR
‑
T细胞经过工程改造以识别特定的肿瘤抗原(TA)，并在一些血液恶性肿瘤中取得了所未有的临床效果，例如非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病。然而，CAR
‑
T细胞疗法可能会产生毒性作用，最常见的是全身细胞因子反应综合征和CAR
‑
T细胞相关脑病综合征。与此同时，双特异性T细胞接合器也已经被提出，例如BiTE，以将内源性免疫效应T细胞重定向到肿瘤附近，并在诱导的免疫突触内聚集CD3T细胞受体(T cell receptor，TCR)复合物，从而触发T细胞信号转导。与CAR
‑<br/>T细胞疗法一样，BiTE疗法也受到毒性的限制。除细胞毒性之外，以T细胞为基础的免疫治疗还受到诸多挑战，例如研究发现尽管免疫系统可以阻止肿瘤的发展，但通过一种称为“免疫逃逸”的过程，许多癌症细胞能够逃避机体免疫系统的监视和清除，T细胞受免疫逃逸影响较大，肿瘤细胞可通过调低或突变细胞抗原受体T细胞受体或表达免疫检查点表面抗原，而规避T细胞的杀伤作用，这也是T细胞治疗肿瘤过程中面临的主要问题之一。正是基于上述原因，研究人员开始关注T细胞之外的免疫细胞，以便开发出更加有效、使用方便的抗肿瘤疗法。
[0004]在这一背景下，NK细胞，即自然杀伤细胞(Natural Killer Cell，NK)，逐渐受到重视，NK细胞在肿瘤监测中的作用是公认的，尤其是在控制血癌和肿瘤转移中的作用尤为突出，例如，肿瘤患者转移的淋巴结中NK细胞激活受体NKp30和NKG2D的表达水平与转移水平呈负相关；在转移性前列腺癌患者中，来自具有较长总生存期和去势抵抗性患者的NK细胞表现出高表达水平的激活受体和高细胞毒性；在小鼠转移模型中，NK细胞的耗竭以及IFN
‑
γ或穿孔素的遗传缺陷导致小鼠的转移水平升高。
[0005]除了NK细胞在直接肿瘤监测中的作用外，NK细胞还有助于T细胞抗肿瘤免疫。在小鼠模型中，NK细胞促进T
‑
bet
+ CD4
+ T细胞在肿瘤区域的积累，通过肿瘤浸润CD8
+ T细胞促进效应分子TNF
‑
α和IFN
‑
γ的产生，抑制这些CD8
+ T细胞中衰竭标志物PD
‑
1的表达，并促进肿瘤特异性T细胞记忆的诱导。体外数据表明，NK细胞可能通过以NKG2D依赖性方式产生IFN
‑
γ来促进抗肿瘤Th1细胞的分化。此外，在小鼠模型中，NK细胞是常规I型树突状细胞
(cDC1)在肿瘤中积累所必需的，因为NK细胞会产生CCL5和XCL1化学引诱物，这种cDC1的募集对于T细胞抗肿瘤免疫至关重要。上述证据表明，NK细胞在形成有效的抗肿瘤T细胞反应中作为“帮助者”的作用。
[0006]NK细胞具有多重免疫调节作用，其来源也相当广泛，目前已经或拟用于临床的NK细胞包括：(1)同种异体NK细胞，将来自健康人的NK细胞经过体外培养和驯化后倒入患者体内，由于NK细胞本身的免疫原性不强，故可以避免令人担忧的移植物抗宿主病(GVHD)，这种方式已经用于造血干细胞移植(HSCT)治疗急性白血病患者中，不仅能够有效抑制GVHD，还能够巩固和强化白血病的治疗作用；(2)自体NK细胞，从患者的外周血中分离和体外扩增NK细胞，然后回输到患者体内，理论上可完全避免GVHD，但是自体NK细胞的功能状态和扩增能力往往较差，且患者NK细胞可能已经受到肿瘤微环境的干扰，使得其临床疗效不佳，有人试图通过激活细胞因子(IL
‑
2、IL
‑
12、IL
‑
15、IL
‑
18等)的不同组合以及在离体扩增期间使用饲养细胞来解决自体NK细胞的培养问题，截止目前尚处于研究之中；(3)成熟NK细胞系，鉴于从外周血中获取大量细胞毒性NK细胞的困难，研究人员开发出了可传代培养的NK细胞系，其中临床上广泛应用的NK92细胞，有一些临床试验证明了NK92细胞作为癌症治疗剂的安全性，但由于其为一种永生化的细胞系，故潜在的致瘤性仍未得到彻底解决；(4)诱导NK细胞，NK细胞可以从干细胞分化而来，包括诱导多能干细胞(iPSC)和从脐带血中获得的干细胞，最近人们从外周血细胞产生的iPSC中提取NK细胞，这种NK细胞表现出低KIR表达，并且在体外对癌细胞系具有细胞毒性作用。
[0007]尽管NK细胞具有较强的免疫调节作用和相对丰富的细胞来源，但是NK细胞疗法仍面临一些困难，其中之一就是如何有效激活NK细胞，并使其富集到肿瘤细胞附近。最近，双特异性杀伤细胞接合剂(bispecific killer cell engagers，BiKE)的产生为解决这一困境提供了新的希望。BiKEs是由两个具有不同特异性的scFv通过柔性接头复合在一起，一种scFv靶向肿瘤抗原(例如CD19、CD20、CD33)，而另一种对NK细胞受体具有特异性，可有效地将癌细胞和NK细胞聚集在一起，促进免疫突触的形成，并允许NK细胞特异性有效地执行其溶细胞功能。BiKEs的主要靶标是CD16，因为它有效地诱导NK激活而无需额外的共刺激，CD16BiKE已被有效地用于靶向表达CD19、CD20、CD33、CD133和EpCAM的肿瘤细胞。
[0008]CD19是肿瘤免疫治疗中的明星靶点，靶向CD19的CAR
‑
T细胞在B细胞白血病和淋巴瘤患者中显示出巨大的临床疗效，尤其是针对接受传统化疗方案后复发的患者仍然有效。在一项针对111名难治性B细胞淋巴瘤患者的II期研究中，其中101名接受了CD19 CAR
‑
T细胞治疗，40％的患者在治疗15个月后疾病完全缓解(Neelapu SS,Locke FL,et al.Axicabtagene Ciloleucel CAR T
‑
Cell Therapy in Refractory Large B
‑
Cell Lymphoma.N.Engl.J.Med，2017，377,2531
–...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体包括靶向CD16抗原结合域和靶向CD19抗原结合域，所述靶向CD16抗原结合域的重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2和SEQ ID NO:3所示的HCDR3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的LCDR1、SEQ ID NO:5所示的LCDR2和SEQ ID NO:6所示的LCDR3；所述靶向CD19抗原结合域的重链可变区包括如SEQ ID NO:7所示的HCDR1、SEQ ID NO:8所示的HCDR2和SEQ ID NO:9所示的HCDR3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:10所示的LCDR1、SEQ ID NO:11所示的LCDR2和SEQ ID NO:12所示的LCDR3。2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述靶向CD16抗原结合域的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述靶向CD19抗原结合域的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，包括2个靶向CD16抗原结合域和2个靶向CD19抗原结合域以及Fc片段，所述靶向CD16抗原结合域和靶向CD19抗原结合域分别位于Fc片段两侧，且相同抗原结合域位于同侧。5.根据权利要求4所述的双...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚凯庆，刘宏宇，郭天，
申请(专利权)人：济南凛韵海搭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：