猪丁型冠状病毒微滴式数字制造技术

本发明专利技术提供了猪丁型冠状病毒微滴式数字

【技术实现步骤摘要】
猪丁型冠状病毒微滴式数字PCR定量检测引物、探针及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及用于猪丁型冠状病毒微滴式数字
PCR
定量检测引物
、
探针及其应用
。

技术介绍

[0002]现有技术中，猪丁型冠状病毒
(porcine deltacoronavirus
，
PDCoV)
，是一种新发猪肠道冠状病毒，可引起5‑
15
日龄哺乳仔猪腹泻和呕吐，迅速脱水，发病率和死亡率高达
50
％
‑
100
％，各阶段猪均可感染发病，哺乳仔猪受到的危害最严重，易与其他猪病混感或继发多种疾病，致猪死亡率增加，给养猪业造成巨大的经济损失，现已将其列为三类动物疫病
。
[0003]PDCoV
为巢状病毒目
(Nested virus order)、
冠状病毒科
(coronaviridae)、
δ
冠状病毒属
(
δ
coronavirus genus)
，单股正链的
RNA
病毒，基因组约为
25Kb
，包含有两个非翻译区以及7个开放性的阅读框，基因结构为5′
UTR
；
ORF(polymerase protein)1a/1b
；纤突
(spike S)
蛋白；小膜
(envelope
，<br/>E)
蛋白；膜
(membrane
，
M)
蛋白；核衣壳
(nucleocapsid
，
N)
蛋白；非结构蛋白
6(nonstructural protein 6
，
NS6)
和非结构蛋白
7(nonstructural protein 7
，
NS7)
，其中
M
蛋白为高度保守的跨膜蛋白，在病毒的组装
、
出芽以及宿主的免疫调节发挥作用；
N
蛋白参与核衣壳的形成，是病毒主要的结构蛋白，但是哪个基因能准确进行该病毒的检测，不会发生漏检，并不清楚
。
[0004]传统的
PDCoV
检测方法主要包括病毒的分离与鉴定
、
间接免疫荧光试验和间接酶联免疫吸附试验等
。
目前对于
PDCoV
感染进行快速
、
敏感的病原学检测的常用手段是
PCR
和
FQ
‑
PCR
方法，但其存在敏感性低
、
判读需依赖
Ct
值等问题
。
微滴式数字
PCR(Droplet Digital PCR,DDPCR)
是继普通
PCR、
荧光
PCR
之后出现的第三代聚合酶链式反应
(Polymerase Chain Reaction)
技术
。
其原理是
25
μ
L
左右的反应预混液，生成数以万计的纳米级反应体系，并进行
PCR
扩增，利用微滴分析仪对每个微滴进行检测，然后根据统计学中泊松分布原理对阴阳性微滴的数量计算出模板中的目的核酸的起始拷贝数量
。
目前未见
PDCoV ddPCR
方法的报道，本专利技术建立的
ddPCR
检测方法，最低检测限为
1.37copies/
μ
L
，具有极高的敏感性，敏感性远远高于
RT
‑
PCR
与
FQ
‑
PCR
方法
。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了猪丁型冠状病毒微滴式数字
PCR
定量检测引物
、
探针及其应用
。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：
[0007]用于检测猪丁型冠状病毒的引物，所述引物包括
SEQ ID No.4
和
SEQ IDNo.5
所示的核酸序列
。
[0008]猪丁型冠状病毒微滴式数字
PCR
定量检测引物和探针，所述引物包括
SEQ ID No.4
和
SEQ ID No.5
所示的核酸序列，探针为如
SEQ ID No.6
所示的核酸序列
。
[0009]用于检测猪丁型冠状病毒的试剂盒，其包括如上所述的引物或如上所述的引物和探针
。
[0010]如上所述的试剂盒，其特征在于，优选地，其还包括2×
PerfeCTa qPCR Tough Mix。
[0011]一种用于微滴式数字
PCR
定量检测猪丁型冠状病毒的微滴式数字
PCR
定量方法，其特征在于，该方法为非诊断目的的检测方法，其包括如下步骤：
[0012]S1、
提取样品的基因组
RNA
，对基因组
RNA
进行反转录；
[0013]S2、
采用如
SEQ ID No.4、SEQ ID No.5
和
SEQ ID No.6
所示的引物和探针对反转录后的
cDNA
进行
ddPCR
扩增；
[0014]S3、
结果判定
。
[0015]如上所述的微滴式数字
PCR
定量方法，优选地，在步骤
S1
中，将提取的核酸
RNA
每
3.2
μ
L
加入
0.8
μ
l PrimeScript
TM
RT Master Mix(5
×
)
反转录反应体系中，使用
PCR
仪进行反转录，程序为：
37℃15
分钟，
85℃15
秒
。
[0016]如上所述的方法，优选地，在步骤
S2
中，
PCR
反应体系为：
500nmol/L
的如
SEQ ID No.4、SEQ ID No.5
所示引物浓度，
250nmol/L
的如
SEQ ID No.6
所示探针的浓度，2×
PerfeCTa qPCR Tough Mix 12.5
μ
L
，
Fluorescein sodium S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
用于检测猪丁型冠状病毒的引物，其特征在于，所述引物包括
SEQ ID No.4
和
SEQ ID No.5
所示的核酸序列
。2.
猪丁型冠状病毒微滴式数字
PCR
定量检测引物和探针，其特征在于，所述引物包括
SEQ ID No.4
和
SEQ ID No.5
所示的核酸序列，探针为如
SEQ ID No.6
所示的核酸序列
。3.
用于检测猪丁型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的引物或包括权利要求2所述的引物和探针
。4.
如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其还包括2×
PerfeCTa qPCR Tough Mix。5.
一种用于微滴式数字
PCR
定量检测猪丁型冠状病毒的方法，其特征在于，该方法为非诊断目的的检测方法，其包括如下步骤：
S1、
提取样品的基因组
RNA
，对基因组
RNA
进行反转录；
S2、
采用如
SEQ ID No.4、SEQ ID No.5
和
SEQ ID No.6
所示的引物和探针对反转录后的
cDNA
进行
ddPCR
扩增；
S3、
结果判定
。6.
如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤
S1
中，将提取的核酸
RNA
每
3.2
μ
L
加入
0.8
μ
l PrimeScript

【专利技术属性】
技术研发人员：闫若潜，班付国，刘影，周建浩，王东方，王淑娟，马震原，谢彩华，赵雪丽，郭育培，柴茂，杨海波，王翠，刘梅芬，赵美雪，张利平，吕圆圆，任雪健，康台生，胡煜锋，单博文，
申请(专利权)人：禾旭郑州生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：