【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品和饲料检测，具体涉及一种毒素三联化学发光检测试剂盒及其应用。
技术介绍
1、食品和饲料的毒素滋生和污染时有发生，严重威胁人类和动物的健康安全。目前市面上已有的检测方法操作复杂，耗时长，很多还需要大型仪器，不利于现场检测和大规模推广。
技术实现思路
1、鉴于此，本专利技术提供一种毒素三联化学发光检测试剂盒及其应用，以解决技术背景中记载的上述问题。
2、为了达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、本专利技术提供一种毒素三联化学发光检测方法，包括以下步骤：步骤一、制备毒素与猝灭剂偶联物；步骤二、将毒素单抗与发光剂进行偶联制备单抗发光物；步骤三、制备纯化毒素的亲和磁珠；步骤四、对样品进行前处理；步骤五、将已处理样品、亲和磁珠、毒素淬灭剂偶联物和单抗发光物，放入自动化设备进行检测。
4、在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述步骤一具体包括黄曲霉毒素b1与bhq1的偶联、玉米赤霉烯酮与bhq1的偶联和呕吐毒素与bhq2的偶联；其中黄曲霉毒素b1与bhq1的偶联或玉米赤霉烯酮与bhq1的偶联的步骤为：s11、称取20mg黄曲霉毒素b1或玉米赤霉烯酮标准品，加入5ml吡啶溶解；s12、称取羧甲基羟胺半盐酸盐40mg，并加入4ml吡啶溶解；s13、将4ml配好的羧甲基羟胺半盐酸盐加入到5ml黄曲霉毒素b1或玉米赤霉烯酮溶液中，避光室温搅拌反应22小时；反应完毕后，放入真空干燥机，25℃温度下抽干；s14、加入5ml
5、在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述呕吐毒素与bhq2的偶联的具体步骤为：s21、称取5g无水硫酸钠，加入20ml吡啶震荡1min，然后静置10min，抽取上层吡啶备用；s22、称取20mg呕吐毒素标准品，加入5ml吡啶溶解；s23、称取70mg丁基硼酸加入2ml无水吡啶，溶解后，加入到溶解好的呕吐毒素中，震荡混匀，密封避光25℃静置18h；s24、称取140mg琥珀酸酐加入到2ml无水吡啶中溶解，溶解完毕后，加入到已反应18h的呕吐毒素中，震荡混匀，抽真空，抽完真空后把瓶子密封，然后沸水浴120min；沸水浴完后，抽真空干燥，随后加入2ml氯仿震荡溶解，再加入2ml纯水剧烈震荡2min，吸出上层水相；重复此步骤四次，把吸出的水相进行合并，然后真空抽干；抽干后水相用2ml纯化水震荡溶解，然后用呕吐毒素亲和柱做亲和纯化，纯化后真空抽干；s25、称取5g无水硫酸钠，加入20ml n-n二甲基甲酰胺震荡1min，然后静置10min，抽取上层n-n二甲基甲酰胺备用；s26、称取23mg n-hydroxysucc inimide,加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100umol/l；称取42mg的dcc，加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100umol/l；吸取3ml二甲基甲酰胺把抽干的呕吐毒素溶解，然后再加入1200ul(100umol)n-hydroxysucc inimide和1200ul(100umol)dcc，25℃过夜搅拌22h；s27、称取70mgbhq-2amine加入10mlcb(0.05m ph9.6)溶解，将反应好的半抗原按10ul每次慢慢加入bhq-2溶液中，然后放置4℃搅拌过夜；s28、15000rpm离心10min，去除沉淀，把溶液ph调到3，用5ml乙酸乙酯抽提，重复5次(加5ml乙酸乙酯，震荡2min，8000rpm离心2min，取上层乙酸乙酯到另外一个离心管，重复此步骤5次)，把上清乙酸乙酯合并，放置到真空干燥机，25℃抽干；s29、把沉淀用5ml甲醇溶解，避光保存备用。
6、在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述步骤二包括，量取2.6mg/ml的黄曲霉毒素b1单抗5ml，用分子量10万mi ll ipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为pbs，超滤完成后用pbs调整蛋白浓度为5mg/ml；称取2.5mg 6-fam nhs ester，加入200uln-n二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液,缓缓加入到黄曲霉b1单抗溶液中，一边加一边搅拌，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量10万mi ll ipore超滤管超滤4次，除去未标记的6-fam nhs ester和盐类小分子,得到标记的6fam-afb1单抗发光物。
7、在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述步骤二包括，量取3.2mg/ml的玉米赤霉烯酮单抗5ml，用分子量10万mi ll ipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为pbs，超滤完成后用pbs调整蛋白浓度为5mg/ml；称取3mg atto rho6g nhs ester，加入200uln-n二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液缓缓加入到玉米赤霉烯酮单抗溶液中，一边加一边搅拌，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量10万mi ll ipore超滤管超滤4次，除去未标记的atto rho6g nhs ester和盐类小分子，得到atto rho6g-zen单抗发光物。
8、在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述步骤二包括，量取2.8mg/ml的don单抗5ml，用分子量10万mi ll ipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为pbs，超滤完成后用pbs调整蛋白浓度为5mg/ml；称取2.6mg cy5 nhs ester，加入200uln-n二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液缓缓加入到don单抗溶液中,一边加一边搅拌,，然后25℃本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种毒素三联化学发光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述毒素三联化学发光检测方法，其特征在于，所述步骤一具体包括黄曲霉毒素B1与BHQ1的偶联、玉米赤霉烯酮与BHQ1的偶联和呕吐毒素与BHQ2的偶联；其中黄曲霉毒素B1与BHQ1的偶联或玉米赤霉烯酮与BHQ1的偶联的步骤为：
3.根据权利要求2所述的毒素三联化学发光检测方法，其特征在于：所述呕吐毒素与BHQ2的偶联的具体步骤为：
4.根据权利要求2所述的毒素三联化学发光检测方法，其特征在于：所述步骤二包括，量取2.6mg/ml的黄曲霉毒素B1单抗5ml，用分子量10万Millipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS调整蛋白浓度为5mg/mL；称取2.5mg 6-FAM NHS Ester，加入200ulN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液,缓缓加入到黄曲霉B1单抗溶液中，一边加一边搅拌，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量10万Millipore超滤管超滤4次，除去未标记的6-FAM NHS Ester和盐类小分子,得到标记
5.根据权利要求2所述的毒素三联化学发光检测方法，其特征在于：所述步骤二还包括，量取3.2mg/ml的玉米赤霉烯酮单抗5ml，用分子量10万Millipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS调整蛋白浓度为5mg/mL；称取3mg Atto Rho6G NHSester，加入200ulN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液缓缓加入到玉米赤霉烯酮单抗溶液中，一边加一边搅拌，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量10万Millipore超滤管超滤4次，除去未标记的Atto Rho6G NHS ester和盐类小分子，得到AttoRho6G-ZEN单抗发光物。
6.根据权利要求2所述的毒素三联化学发光检测方法，其特征在于：所述步骤二还包括，量取2.8mg/ml的DON单抗5ml，用分子量10万Millipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS调整蛋白浓度为5mg/mL；称取2.6mg Cy5 NHS ester，加入200ulN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液缓缓加入到DON单抗溶液中,一边加一边搅拌,，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量量10万Millipore超滤管超滤4次，除去未标记的Cy5 NHS ester和盐类小分子,得到Cy5-DON单抗发光物。
7.根据权利要求1所述的毒素三联化学发光检测方法，其特征在于：所述步骤三亲和磁珠的制备，包括：
8.根据权利要求2所述的毒素三联化学发光检测方法，其特征在于：所述步骤四样品前处理，包括一般检测样品前处理和特殊检测样品前处理。
9.根据权利要求2所述的毒素三联化学发光检测方法，其特征在于：所述步骤五将已处理样品、毒素淬灭剂偶联物和单抗发光物混合放入设备检测，具体为：将校准品和洗脱后毒素样品200μL分别加入到对应的微孔中，随即加入单抗发光物50μL/孔和毒素淬灭剂偶联物50μL/孔，轻轻振荡混匀，放入化学发光分析仪，5min后读数。
10.一种毒素三联化学发光检测方法的应用，其特征在于：毒素三联化学发光检测方法应用于食品和饲料的检测。
...【技术特征摘要】
1.一种毒素三联化学发光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述毒素三联化学发光检测方法，其特征在于，所述步骤一具体包括黄曲霉毒素b1与bhq1的偶联、玉米赤霉烯酮与bhq1的偶联和呕吐毒素与bhq2的偶联；其中黄曲霉毒素b1与bhq1的偶联或玉米赤霉烯酮与bhq1的偶联的步骤为：
3.根据权利要求2所述的毒素三联化学发光检测方法，其特征在于：所述呕吐毒素与bhq2的偶联的具体步骤为：
4.根据权利要求2所述的毒素三联化学发光检测方法，其特征在于：所述步骤二包括，量取2.6mg/ml的黄曲霉毒素b1单抗5ml，用分子量10万millipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为pbs，超滤完成后用pbs调整蛋白浓度为5mg/ml；称取2.5mg 6-fam nhs ester，加入200uln-n二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液,缓缓加入到黄曲霉b1单抗溶液中，一边加一边搅拌，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量10万millipore超滤管超滤4次，除去未标记的6-fam nhs ester和盐类小分子,得到标记的6fam-afb1单抗发光物。
5.根据权利要求2所述的毒素三联化学发光检测方法，其特征在于：所述步骤二还包括，量取3.2mg/ml的玉米赤霉烯酮单抗5ml，用分子量10万millipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为pbs，超滤完成后用pbs调整蛋白浓度为5mg/ml；称取3mg atto rho6g nhsester，加入200uln-n二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液缓缓加入到玉米赤霉烯酮单抗溶液中，一边加一边搅拌，然后25℃...
【专利技术属性】
技术研发人员：李秀梅，杨志，刘近，任雪建，吕园园，杨转，刘明瑞，杨晓帆，李亚静，阴笑丹，阴思晴，陶飞飞，赵晓月，余金良，牛然，王政，张洪军，王玉恒，江涛，
申请(专利权)人：禾旭郑州生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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