一种用于治疗缺血性痴呆的干细胞提取方法技术

本发明专利技术公开了一种用于治疗缺血性痴呆的干细胞提取方法，涉及到生物领域，以下操作步骤：准备提取，准备若干雄性健康的大鼠，大鼠体重为

【技术实现步骤摘要】
一种用于治疗缺血性痴呆的干细胞提取方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体为一种用于治疗缺血性痴呆的干细胞提取方法
。

技术介绍

[0002]脑卒中是由脑血管阻塞或者脑血管狭窄引起的，这会导致脑部区域血流量逐渐减少或突然停止，诱发系列级联反应，缺血缺氧造成供血区的脑组织局部不可逆坏死和软化，伴随相应的神经元死亡，从而引发神经功能障碍
。
[0003]脑卒中具有高发病率
、
高致残率
、
高死亡率
、
高复发率
、
高经济负担五大特点，脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中占比为
87
％，是主要的疾病类型，目前缺血性脑卒中治疗药物中主要包括两种药物：改善脑血液循环药和神经保护剂，脑血液循环药包括溶栓药，抗凝剂和抗血小板聚集药物，其中溶栓药有重组组织型纤溶酶原激活剂
(rtPA)、
尿激酶和替耐普酶等，溶栓药是唯一被
FDA
批准的用于抗急性缺血性脑卒中的药物，但存在治疗时间窗短，易引发出血转化等风险
。
因此如何防治缺血性脑卒中仍然是现代医学的一个重要问题，迫切需要探索一个新的治疗手段和研究新的药物
。

技术实现思路

[0004]针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本专利技术提供一种用于治疗缺血性痴呆的干细胞提取方法，有效的解决了
技术介绍
中的问题
。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种用于治疗缺血性痴呆的干细胞提取方法，包括以下操作步骤：
[0006]S1、
准备提取，准备若干雄性健康的大鼠，大鼠体重为
250
‑
300g
，准备显微镊
、
显微镜和多个培养皿；
[0007]S2、
仪器消毒，将
S1
中准备的显微镊和多个培养皿进行消毒，并在多个培养皿中放入解剖液；
[0008]S3、
大鼠致死，取1‑2只大鼠，将大鼠放入密封箱体中，并向箱体中充入二氧化碳，放置
30
‑
60
分钟，使大鼠死亡；
[0009]S4、
干细胞提取，将
S3
中致死的大鼠头部和躯体分离，取下大鼠的鼻甲和鼻中隔并放入其中一个培养皿中，然后将大鼠的头部放置在显微镜下，再通过显微镊轻轻剥下大鼠的嗅上皮组织，并将嗅上皮组织放入另一个培养皿中；
[0010]S5、
重悬细胞制备，在含有嗅上皮组织的培养皿中放入中性蛋白酶
PBS
溶液，并将培养皿置于
30
‑
45℃
的温室中消化
40
‑
50
分钟，然后在显微镜下用显微镊将消化后的嗅上皮组织的上皮层和固有层进行分离，分别放入两个含有
PBS
溶液的培养皿中，且分别在两个培养皿中放入不同的消化液，对上皮层和固有层进行消化，消化完毕后，将上皮层和固有层进行合并，最后进行离心，制得重悬细胞溶液；
[0011]S6、
将制得的重悬细胞种植于无菌培养皿中，依次进行原代培养和隔代培养，获得可用于治疗缺血性痴呆的嗅上皮神经干细胞
。
[0012]优选的，
S1
中所述大鼠术前禁食
12
小时，自由饮水，在第一天对大鼠进行电凝闭塞双侧椎动脉并在双侧颈总动脉埋线备用，在第二天打开大鼠颈前切口，用微动脉夹轻轻夹闭双侧颈总动脉，
20min
后撤去双侧动脉夹，并对大鼠腹腔注射青霉素以抗感染
。
[0013]优选的，
S2
中所述显微镊和多个培养皿在消毒时，首先采用手工清洗，然后放在
1:10
的多酶清洗液中浸泡3～5分钟，水温控制在
40
～
45℃
，使用专用的小毛刷彻底清洁其管道及缝隙和齿槽部位；
[0014]再在超声清洗机内清洗5～
10
分钟，清洗时水温控制在
40
～
45℃
，功率强度
30
～
40kHz
；
[0015]在清洗机内，用蒸馏水流动漂洗
、
冲洗
、
上油
、
烘干，完成清洗消毒
。
[0016]优选的，
S5
中中性蛋白酶
PBS
溶液浓度为
2.4U/ml
，所述上皮层组织所在培养皿中的消化液为
10
μ
g/mlDNA
酶和
0.125
％胰酶溶液，所述固有层组织所在培养皿中消化液为
0.25
％Ⅰ型胶原酶溶液，且上皮层组织和固有层组织均消化
10
分钟
。
[0017]优选的，
S5
中对上皮层和固有层的离心速度为
1000r/min
，且离心时间为
10
分钟
。
[0018]优选的，所述重悬细胞原代培养，将重悬的细胞种植于事先准备好的
PLL
包被的无菌培养皿中
37℃、5
％
CO2
湿度
95
％细胞培养箱中促贴壁
12h
，
PLL
包被及血清促贴壁
12h
后，换成无血清完全培养基中，
37℃
，5％
CO2
孵箱培养，每两天换液一次；
[0019]原代培养8～
12d
后，细胞可增殖长满培养皿，此时细胞用
0.25
％
trypsin37℃
消化
10min
，再用含
10
％
FBS
的
DMEM/F12
培养液终止消化，离心后细胞重悬于完全培养基中，以2×
104
‑9×
104
个
/cm2
的密度分别种于
PLL
包被过的培养皿中，
37℃、5
％
CO2
贴壁培养，每两天更换培养液，并计算形成增殖球的数量
。
[0020]本专利技术的技术效果和优点：
[0021]1、
通过体外分离获得大鼠的嗅觉干细胞，具有体外增殖和分化能力，并且在没有神经支持的情况下可以分化为具有活性的嗅觉细胞，并可对嗅上皮神经干细胞进行大量培养增殖，通过干细胞移植从而治疗缺血性脑卒中，此方法有助于丰富神经干细胞对缺血性脑卒中治疗发展，对于寻找新型潜在的抗缺血性脑卒中具有重要的意义
。
具体实施方式
[0022]本专利技术提供了一种用于治疗缺血性痴呆的干细胞提取方法，包括以下操作步骤：...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于治疗缺血性痴呆的干细胞提取方法，其特征在于：包括以下操作步骤：
S1、
准备提取，准备若干雄性健康的大鼠，大鼠体重为
250
‑
300g
，准备显微镊
、
显微镜和多个培养皿；
S2、
仪器消毒，将
S1
中准备的显微镊和多个培养皿进行消毒，并在多个培养皿中放入解剖液；
S3、
大鼠致死，取1‑2只大鼠，将大鼠放入密封箱体中，并向箱体中充入二氧化碳，放置
30
‑
60
分钟，使大鼠死亡；
S4、
干细胞提取，将
S3
中致死的大鼠头部和躯体分离，取下大鼠的鼻甲和鼻中隔并放入其中一个培养皿中，然后将大鼠的头部放置在显微镜下，再通过显微镊轻轻剥下大鼠的嗅上皮组织，并将嗅上皮组织放入另一个培养皿中；
S5、
重悬细胞制备，在含有嗅上皮组织的培养皿中放入中性蛋白酶
PBS
溶液，并将培养皿置于
30
‑
45℃
的温室中消化
40
‑
50
分钟，然后在显微镜下用显微镊将消化后的嗅上皮组织的上皮层和固有层进行分离，分别放入两个含有
PBS
溶液的培养皿中，且分别在两个培养皿中放入不同的消化液，对上皮层和固有层进行消化，消化完毕后，将上皮层和固有层进行合并，最后进行离心，制得重悬细胞溶液；
S6、
将制得的重悬细胞种植于无菌培养皿中，依次进行原代培养和隔代培养，获得可用于治疗缺血性痴呆的嗅上皮神经干细胞
。2.
根据权利要求1所述的一种用于治疗缺血性痴呆的干细胞提取方法，其特征在于：
S1
中所述大鼠术前禁食
12
小时，自由饮水，在第一天对大鼠进行电凝闭塞双侧椎动脉并在双侧颈总动脉埋线备用，在第二天打开大鼠颈前切口，用微动脉夹轻轻夹闭双侧颈总动脉，
20min
后撤去双侧动脉夹，并对大鼠腹腔注射青霉素以抗感染
。3.
根据权利要求2所述的一种用于治疗缺血性痴呆的干细胞提取方法，其特征在于：
S2
中所述显微镊和多个培养皿在消毒时，首先采用手工清洗，然后放在
1:10
的多酶清洗液中浸泡3～5分钟，水温控制在
40
～
45℃
，使用专用的小毛刷彻底清洁其管道及缝隙和齿槽部位；再在超声清洗机内清洗5～
10
分钟，超声清洗是...

【专利技术属性】
技术研发人员：何文丽，
申请(专利权)人：上海中赛德康生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：