一种检测金黄色葡萄球菌蛋白制造技术

本申请涉及医学检验领域，具体公开了一种检测金黄色葡萄球菌蛋白

【技术实现步骤摘要】
一种检测金黄色葡萄球菌蛋白A的试剂盒及其应用


[0001]本申请涉及医学检验领域，更具体地说，它涉及一种检测金黄色葡萄球菌蛋白
A
的试剂盒及其应用
。

技术介绍

[0002]近年来，随着基因工程技术的发展以及细胞大规模培养技术的发展
。
尤其抗体药物的工业化生产已经取得了长足的进步
。
诞生了多个重磅炸弹级的基于抗体的抗肿瘤药物及其他领域药物
。
在抗体药物的生产工艺中，通常包括大规模的细胞培养，抗体在细胞中的高效表达，细胞破碎以及抗体的纯化等工序
。
其中抗体的纯化是关键的工序，在抗体的纯化过程中，需要将裂解的细胞碎片
、
细胞内容物中的杂质蛋白等成分去除
。
在依赖于细胞培养上清的分泌型抗体生产工艺中，同样需要去除细胞碎片
、
培养基组分中的杂质
。
因此，在抗体药物的生产中，往往需要多个层析纯化的步骤
。
在这其中，亲和层析以其操作简便，特异性强，回收率高等优点，在药物生产尤其是抗体药物的生产中起到关键作用
。
[0003]金黄色葡萄球菌蛋白
A(Staphylococcal Protein A)
是源于金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质
。1940
年最先由
Vevwey
等发现，直到
1963
年
Lofkvis
等分离了这一蛋白，随后
Grov
将其命名为
SPA。SPA
存在于多数金黄色葡萄球菌中
。
[0004]SPA
可与人类和多种哺乳动物
IgG
的
Fc
段结合
。
这一特性被广泛用于人类和动物抗体的纯化
。
在目前的抗体制药工艺中，常利用
SPA
作为亲和层析的配基，特异性的通过亲和层析的方式纯化培养液中的抗体
。
通常的使用方式是，将
SPA
通过化学键偶联在层析载体上，这种载体可以是琼脂糖凝胶，表面修饰的聚苯乙烯树脂，以及其他的层析载体
。
制备而成的载体简称为
SPA
亲和层析载体
。
[0005]基于
SPA
的亲和层析是抗体纯化中非常重要的技术
。
由于其操作步骤少，抗体得率高，所获得的的抗体纯度高，所以无论是在实验室研究中，还是在制药工业中都有广泛的使用
。
[0006]在利用
SPA
亲和层析工艺的抗体纯化过程中，作为亲和层析配基的
SPA
会由于各种原因，产生脱落现象，从层析柱上脱落的
SPA
会进入到纯化后的抗体而影响抗体的纯度
。
在抗体制药工业中，
SPA
的脱落会影响抗体药物的质量，如果进入到人体可能会引发免疫反应等一系列症状
。
[0007]因此，确定在纯化的抗体中是否有
SPA
的残留非常重要
。SPA
残留检测也成为抗体药物质量控制的重要环节
。
[0008]相关技术中，利用人
IgG
分子的
Fc
段能与待检物中
SPA
相结合的原理，以人
IgG
作为捕获分子，在抗体药物的检测中，由于待检物本身便可能存在大量的
IgG
抗体，通常是人源化的
IgG
抗体，因此待检物中的
SPA
会首先与待检物中的
IgG
抗体分子的
Fc
部分相结合，从而无法与
ELISA
板上作为捕获分子的人
IgG
相结合，最终呈现假阴性，导致金黄色葡萄球菌蛋白
A
的检测准确性降低
。

技术实现思路

[0009]为了提高金黄色葡萄球菌蛋白
A
的检测准确性，本申请提供一种检测金黄色葡萄球菌蛋白
A
的试剂盒及其应用
。
[0010]第一方面，本申请提供一种检测金黄色葡萄球菌蛋白
A
的试剂盒，采用如下的技术方案：
[0011]一种检测金黄色葡萄球菌蛋白
A
的试剂盒，包括：
[0012]包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体的微孔板；
[0013]金黄色葡萄球菌蛋白
A
标准品；
[0014]生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体
F(ab)2片段；
[0015]酶标记的抗生物素蛋白；
[0016]样品稀释液；
[0017]显色液；
[0018]洗涤液；
[0019]终止液
。
[0020]通过采用上述技术方案，制备了鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体作为捕获抗体，大幅度降低了待检物金黄色葡萄球菌蛋白
A
与抗体的非特异性结合，检测的特异性大大提高，有效的避免了检测的非特异性；同时，利用鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体
F(ab)2片段特异性的结合金黄色葡萄球菌蛋白
A
进行检测，切除了能够与金黄色葡萄球菌蛋白
A
产生结合的抗体恒定区
Fc
片段，增加了检测的灵敏度，因此，获得了提高金黄色葡萄球菌蛋白
A
的检测准确性的效果
。
[0021]可选的，鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体为鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
的
IgY
多克隆抗体，且在
pH
为3‑7的环境中能够保持活性
。
[0022]通过采用上述技术方案，利用了耐酸的鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体作为捕获抗体，使试剂盒检测样本的范围扩大，减少了检测前的样本酸碱度调节的工作，能够满足制药工业中样本的直接检测
。
并且，由于样本的酸碱度调节，会因为在样本中加入酸或者碱调节
pH
值而改变原样本中待检物的浓度，本方案则可利用原样本直接检测，更进一步增加了检测的准确性
。
[0023]可选的，包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体的微孔板制备方法如下：
[0024]S1、
制备鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体；
[0025]S2、
微孔板包被：
[0026]在微孔板中，每孔加入
200ul
用碳酸缓冲液稀释的鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体，进行孵育；
[0027]碳酸缓冲液的浓度为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种检测金黄色葡萄球菌蛋白
A
的试剂盒，其特征在于，包括：包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体的微孔板；金黄色葡萄球菌蛋白
A
标准品；生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体
F(ab)2片段；酶标记的抗生物素蛋白；样品稀释液；显色液；洗涤液；终止液
。2.
根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌蛋白
A
的试剂盒，其特征在于，鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体为鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
的
IgY
多克隆抗体，且在
pH
为3‑7的环境中能够保持活性
。3.
根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌蛋白
A
的试剂盒，其特征在于，包被有鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体的微孔板制备方法如下：
S1、
制备鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体；
S2、
微孔板包被：在微孔板中，每孔加入
200ul
用碳酸缓冲液稀释的鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体，进行孵育；碳酸缓冲液的浓度为
10mM
‑
100mM
，缓冲对为
Na2CO3和
NaHCO3，
pH
为9‑
10
；鸡抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体的浓度为1‑
10
μ
g/ml
；孵育条件为
4℃
过夜；
S3、
微孔板洗涤
、
封闭
、
干燥
。4.
根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌蛋白
A
的试剂盒，其特征在于，金黄色葡萄球菌蛋白
A
标准品的配制方法为：将金黄色葡萄球菌蛋白
A
溶解在标准品缓冲液中，配制成金黄色葡萄球菌蛋白
A
标准品，金黄色葡萄球菌蛋白
A
的浓度为
10ng/ml
‑
500ng/ml
，标准品缓冲液为浓度
20mM
‑
50mM、pH6.5
‑
pH8.5
的磷酸缓冲液
。5.
根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌蛋白
A
的试剂盒，其特征在于，生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体
F(ab)2片段的制备方法如下：
S1、
由金黄色葡萄球菌蛋白
A
免疫小鼠后筛选得到鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体；
S2、
对鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体采用木瓜蛋白酶酶切法制备
F(ab)2片段，然后采用亲和层析法纯化，亲和层析介质采用链球菌蛋白
G
，制得纯化的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体
F(ab)2片段；
S3、
采用
N
‑
羟基琥珀酰亚胺对
S2
制得的纯化的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白
A
抗体
F(ab)2片段进行标记，制得生物素标记的鼠抗金黄色葡萄球菌蛋白

【专利技术属性】
技术研发人员：张彦明，刘明，潘文东，
申请(专利权)人：武汉睿奇生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：