CD38制造技术

本发明专利技术提供一种

【技术实现步骤摘要】
CD38基因敲除的Raji
‑
Luc细胞系构建方法及其细胞系


[0001]本专利技术涉及细胞
，特别涉及
CD38
基因敲除的
Raji
‑
Luc
细胞系构建方法及其细胞系
。

技术介绍

[0002]淋巴瘤是最常见的血液肿瘤之一，主要分为非霍奇金淋巴瘤
(non
‑
hodgkin lymphoma,NHL)
和霍奇金淋巴瘤
(hodgkin lymphoma,HL)
两类
。
其中，非霍奇金淋巴瘤占所有淋巴瘤的
90
％，
B
细胞非霍奇金淋巴瘤的发病率是
T
细胞淋巴瘤的三倍
。
其发病率随年龄段呈上升趋势，年龄超过
60
岁的长者患病的可能性较大，致死率较高
。
[0003]CD38
，也称为环状
ADP
核糖水解酶，
CD38
是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，由
45kD
的单链组成，具有受体和酶双重功能，与其配体
CD31
结合后可与其他细胞表面受体相互作用，参与细胞与细胞间的黏附，激活细胞内信号传导途径，进而促进细胞增殖或凋亡
。
在
CD38
阳性的血液恶性肿瘤中，
CD38
可以调节肿瘤细胞在通过内皮细胞壁时的迁移活动，并且可以促进肿瘤生长增殖
。
最重要的
CD38
在多种血液恶性肿瘤上均匀的表达，且表达量高于正常造血细胞，这使
CD38
成为一个具有吸引力的治疗靶点
。
[0004]嵌合抗原受体基因修饰
T(CAR
‑
T)
细胞疗法是将
T
细胞进行改造，使其表达一个包括抗原识别域
、
共刺激域和
T
细胞激活域的融合蛋白，经过改造的
CAR
‑
T
细胞可以特异性识别并消除表达靶抗原的肿瘤细胞，这项免疫疗法被誉为未来肿瘤治疗的希望
。
经美国食品药品监督管理局
(FDA)
批准上市的
CAR
‑
T
细胞产品有六种，其中四款的靶点为
CD19
，
CD19
靶点研发的巨大成功刺激了其他靶点的研究，但是并不是所有接受治疗的患者
。
然而，约
60
％治疗后复发患者的癌细胞会出现
CD19
表达减少或完全丧失的现象
。
有临床研究指出，一名
B
细胞急性淋巴细胞白血病
(B
‑
cell Acute Lymphoblastic Leukemia,B
‑
ALL)
患者在接受抗
CD19 CAR
‑
T
细胞注入
19
天后病情得到了完全缓解，但在治疗后第
261
天出现病情复发并最终死亡
。
研究人员发现，该患者复发后的白血病细胞均异常表达抗
CD19 CAR
，无法检测到
CD19
的表达
。
因此，尽管
CD19 CAR
‑
T
细胞在治疗
B
细胞恶性肿瘤方面效果显著，但治疗后经常会出现肿瘤复发的现象，而肿瘤复发的主要原因与抗原逃逸有关，可以推论
CD38 CAR
‑
T
推及临床后也会和
CD19 CAR
‑
T
一样出现肿瘤复发的现象
。
[0005]伯基特淋巴瘤
(burkitt lymphoma,BL)
就是一种侵袭性的
B
细胞淋巴瘤，属于非霍奇金淋巴瘤
。1963
年，
Pulvertaft RJV
在一位
11
岁男孩的左上颌骨的
Burkitt
淋巴瘤中分离得到
Raji
细胞，建立了第一个人类造血系统的连续传代细胞
。Raji
细胞的
CD19
和
CD38
呈双阳性表达，常被用做靶细胞进行非霍奇金淋巴瘤的相关研究
。
本专利技术通过
CRISPR cas9
技术，构建了
Raji
‑
Luc CD38 KO
细胞，为后续探索如何解决
CAR
‑
T
细胞疗法由于抗原免疫逃逸而产生的肿瘤复发问题奠定了基础
。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种
CD19
基因敲除的
Raji
‑
Luc
细胞系构建方
法，所述方法包括以下步骤：
[0007]步骤1：设计靶向
CD38
的多个
sgRNA
序列；
[0008]步骤2：用步骤1的多个
sgRNA
序列构建多个
PB
‑
CRISPR
‑
CD38 sgRNA
质粒；
[0009]步骤3：用步骤2的多个
PB
‑
CRISPR
‑
CD38 sgRNA
质粒分别电转染
Raji
‑
Luc
细胞；
[0010]步骤4：用流式细胞仪检测步骤3得到的电转染后
Raji
‑
Luc
细胞的
CD38
敲除效率和利用细胞培养确定细胞生长状态，筛选出最优的
sgRNA
序列；
[0011]步骤5：利用最优的
sgRNA
序列构建的
PB
‑
CRISPR
‑
CD38 sgRNA
质粒批量电转染
Raji
‑
Luc
细胞；
[0012]步骤6：筛选稳定敲除的单克隆
Raji
‑
Luc
细胞株
。
[0013]在一种实施方式中，所述最优的
sgRNA
序列是
SEQ IDNo.1:GCTAGGTCCGAAACATTCCAC。
[0014]在一种实施方式中，在步骤6中，取电转后的
Raji
‑
Luc CD38
细胞，用染色缓冲液重悬细胞，并向其中加入流式抗体避光染色；染色结束后用流式细胞仪检测细胞的转染效率，进行流式分选，将分选后的细胞极限稀释本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CD38
基因敲除的
Raji
‑
Luc
细胞系构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1：设计靶向
CD38
的多个
sgRNA
序列；步骤2：用步骤1的多个
sgRNA
序列构建多个
PB
‑
CRISPR
‑
CD38 sgRNA
质粒；步骤3：用步骤2的多个
PB
‑
CRISPR
‑
CD38 sgRNA
质粒电转染
Raji
‑
Luc
细胞；步骤4：用流式细胞仪检测步骤3得到的电转染后
Raji
‑
Luc
细胞的
CD38
敲除效率和利用细胞培养确定细胞生长状态，筛选出最优的
sgRNA
序列；步骤5：利用最优的
sgRNA
序列构建的
PB
‑
CRISPR
‑
CD38 sgRNA
质粒批量电转染
Raji
‑
Luc
细胞；步骤6：筛选稳定敲除的单克隆
Raji
‑
Luc
细胞株
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述最优的
sgRNA
序列是
SEQ IDNo.1:GGCGGGACATGTTCACCCTGG。3.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤6中，取电转后的
Raji
‑
Luc CD38
细胞，用染色缓冲液重悬细胞，并向...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建勋，冯娅茹，刘秀盈，宋志茹，刘静静，
申请(专利权)人：深圳北京中医药大学研究院，
类型：发明
国别省市：