一种猪繁殖与呼吸综合征重组毒株制造技术

本发明专利技术公开了一种猪繁殖与呼吸综合征重组毒株

【技术实现步骤摘要】
一种猪繁殖与呼吸综合征重组毒株、其构建方法及应用


[0001]本专利技术属于生物制品
，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征重组毒株
、
其构建方法及应用
。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸综合征病毒
(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)
是引起猪繁殖与呼吸综合征
(PRRS)
的病原，该病毒分为基因1型和基因2型两个亚型，根据
ORF5
基因的遗传演化分析结果又将基因2型划分为9个亚系
。
在中国主要存在
1、3、5、8
和9系，
2017
年，我国首次出现
NADC34
‑
like PRRSV
属于1系中的
1.5
亚系，随后相继在别的省份出现该毒株的流行
。NADC34
‑
like PRRSV
的猪场均存在
10
％～
20
％的流产率
。
遗传演化分析，该毒株可能是从美国传入中国的，该谱系与毒株与
2014
年在美国发现的
IA/2014/NADC34
毒株相似，氨基酸序列比对显示，
NADC34
‑
like PRRSV
的
NASP2
蛋白上均存在
100
个氨基酸的连续缺失r/>。
目前
NADC34
‑
like PRRSV
的检出率仍在持续增加，并存在与本地病毒发生重组的风险，增加毒株的复杂程度，使相关猪病的防控变得更加困难，给养猪业造成重大的经济损失
。
[0003]病毒基因组
RNA5
’
端非编码区的前导序列，病毒基因组的
mRNA
转录2个
ORFs
‑
ORF1a
和
ORF1b
，主要编码病毒的复制酶蛋白
。PRRSV
有7个结构蛋白，糖基化蛋白
GP2
～
GP5
主要由
ORF2
～5编码，
ORF6
编码非糖基化膜蛋白
(M
蛋白
)
，
ORF7
编码核衣壳蛋白
(N
蛋白
)
，
ORF2
内还编码一个小的非糖基化蛋白
(E
蛋白
)。
目前研究证明，
GP5
蛋白是产生中和抗体的主要抗原蛋白，此外其它结构蛋白如
GP2、GP3、GP4
以及
M
蛋白都存在病毒中和表位，具有病毒中和能力，在抗
PRRSV
感染的免疫保护中发挥重要的作用
。
研究表明
PRRSV
感染早期由非结构蛋白
2(non
‑
structural protein2
，
NSP2)
和
N
蛋白诱导产生的抗体不具有中和能力，但是
NSP2
蛋白可以参与宿主免疫调控和诱导中和抗体的产生，
NSP2
蛋白含有多个免疫显性线性
B
细胞表位，推测亦有可能还存在
T
细胞表位
。
另外非结构蛋白
NSP9
的序列高度保守，具有较强的免疫原性，含有
T
细胞表位，为提供广泛交叉保护的免疫制剂提供了可能
。NSP9
也是肽疫苗的研究对象
。
[0004]疫苗毒株
(CH
‑
1R
株
)
是
CH
‑
1a
株经细胞传代致弱毒株
,
毒株遗传性状稳定
,
高度安全
,
不会出现毒力返强
。
研究表明，9个氨基酸变异与毒力相关的可能性较大，其中4个位于非结构蛋白区域，5个位于结构蛋白区域，其中
GP3
在感染过程中起到关键作用，
CH
‑
1R
的毒力减弱可能是该氨基酸的变异所致，另外，
CH
‑
1R
的致弱的重要变异主要发生在结构蛋白部分，并具有规律性，
ORF1a
基因的
E
，
ORF5
基因的
LQ
，
ORF6
基因的
Q6L
和
ORF7
基因的
K46N
这四个氨基酸在
CH
‑
1R
致弱过程中发挥了重要的作用
。
[0005]反向遗传技术是一种研究
RNA
病毒的强大工具，该技术已经被广泛应用于探究病毒感染的多方面研究如病毒基因组的转录与复制
、
毒力及靶细胞的感染
、
发病机制
、
免疫反应
、
疫苗开发和抗病毒药物筛选等
。
正链
RNA
病毒的基因组具有传染性，在脱壳进入细胞后基因组
RNA
立即被宿主核糖体翻译产生一个或多个多蛋白，这些蛋白被蛋白酶切割产生病
毒蛋白
。
因而对于正链
RNA
病毒，几乎不需要将额外的复制相关蛋白包裹在病毒粒子中
。PRRSV
反向遗系统的构建策略，主要是通过转染
cDNA
来拯救病毒，将全长
cDNA
克隆在聚合酶Ⅱ启动子下游，产生的
DNA
质粒被转移至易感细胞系即可产生子代病毒
。
目前，人类巨细胞病毒
(CMV)
早期启动子已被广泛使用，同时为确保病毒末端序列的真实性，在
cDNA
序列的5’
和3’
端分别加入锤头状核酶
(Hammerhead Ribozyme
，
HHR)
和丁型肝炎病毒核酶
(Hepatitis delta virus ribozyme
，
HDV Rz)。
研究已经证明基于
DNA
的转染系统产生的病毒滴度是基于
RNA
的转染系统的
10
到
100
倍
。
[0006]目前
PRRS
仍然是危害全球养猪业的主要病原之一，而控制和根除
PRRS
也是各个国家面临的重大问题
。
现有的疫苗还是很难控制
PR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括重组病毒基因片段，所述重组病毒基因片段具体包括
PRRSV JS2021NADC34
毒株的5’
UTR
基因
、
编码非结构蛋白基因
、3
’
UTR
‑
polyA
基因和根据
PRRSV CH
‑
1R
毒株的编码结构蛋白的基因设计的核苷酸序列如
SEQ ID NO:16
所示的基因，所述
PRRSV JS2021NADC34
毒株的编码非结构蛋白基因包括
ORF1a
和
ORF1b
基因；
PRRSV CH
‑
1R
毒株编码结构蛋白的基因包括
ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6
和
ORF7
基因
。2.
根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述重组病毒基因片段的核苷酸序列如
SEQ ID NO:15
所示
。3.
一种猪繁殖与呼吸综合征重组毒株，其特征在于，含有权利要求1～2任一项所述的重组载体
。4.
一种权利要求1所述的重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)
将
PRRSV JS2021NADC34
毒株的5’
UTR
基因
、ORF1a
和
ORF1b
基因
、3
’
UTR
‑
polyA
基因和如
SEQ ID NO:16
所示的基因整合构建出最终的重组病毒基因组序列，并根据合适的酶切位点将整个基因组序列分成
A、B、C、D、E、F
共6段基因片段；
(2)
扩增
A
段基因和
B
段基因并同时插入表达载体，得到第一个中间重组载体；所述
A
段基因的核苷酸序列位于
PRRSV JS2021NADC34
的基因组的第1‑
4069
位，
B
段基因的核苷酸序列位于
PRRSV JS2021NADC34
的基因组的第
4070
‑
7935
位；
(3)
扩增
C
段基因和
D
段基因并同时插入步骤
(2)
得到的中间重组载体，得到第二个中间重组载体；所述
C
段基因的核苷酸序列位于
PRRSV JS2021NADC34
的基因组的第
7936

【专利技术属性】
技术研发人员：李向东，叶正琴，朱振邦，刘金彪，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：