一种固定化双蛋白酶微球及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种固定化双蛋白酶微球及其制备方法和应用，其中，所述固定化双蛋白酶微球是具有介孔结构的球形颗粒，所述固定化双蛋白酶微球是通过外肽酶与金属离子配位自组装构成载体内核，内肽酶与所述载体内核上的所述金属离子配位杂化得到的

【技术实现步骤摘要】
一种固定化双蛋白酶微球及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及食品与生物化工
，更具体的说是涉及一种固定化双蛋白酶微球及其制备方法和应用，尤其涉及制备生物活性肽相关产品的应用
。

技术介绍

[0002]生物活性肽是通过酶促水解
、
微生物发酵
、
食品加工等手段从食源性蛋白质或食品中获得的，较亲本蛋白具有更高的生物活性和生物利用度，更低的致敏性，应用前景广阔
。
通过蛋白酶水解蛋白质是制备生物活性肽的一种主要手段，但蛋白酶目前多以游离态为主，造成游离蛋白酶回收困难
、
无法重复利用
、
稳定性差等问题，且会发生相互识别的自水解以及蛋白分子自聚集现象，无法满足工业生产的规模化需求
。
[0003]目前，固定化方法例如物理吸附法
、
包埋法
、
化学交联法
、
共价结合法等可以一定程度上提高蛋白酶的活性稳定性，但仍然存在酶分子泄露
、
活性损失等缺点
。
此外，蛋白酶由于识别位点的不同，导致酶解制备的多肽分子量不可控
。
[0004]综上，如何提供一种可提高蛋白酶催化效率
、
酶活性稳定
、
可重复利用及生物活性肽分子量可控的蛋白酶是本领域技术人员亟需解决的问题
。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种固定化双蛋白酶微球及其制备方法，和利用固定化双蛋白酶微球制备生物活性肽的方法
。
本专利技术提供的固定化双蛋白酶微球不仅酶活性稳定，可重复使用，且能够提高蛋白酶的催化效率，同时制备的生物活性肽分子量可调可控
。
[0006]本专利技术的目的之一是提供一种固定化双蛋白酶微球，所述固定化双蛋白酶微球是具有介孔结构的球形颗粒，粒径在
10
‑
30
μ
m
，比表面积
10
‑
50m2/g
，孔体积为
0.1
‑
0.3cm3/g
，平均孔径为
40
‑
100nm
；
[0007]所述固定化双蛋白酶微球是通过外肽酶与金属离子配位自组装构成载体内核，内肽酶与所述载体内核上的所述金属离子配位杂化得到的
。
[0008]且所述固定化双蛋白酶微球中包括一种内肽酶和一种外肽酶；
[0009]所述固定化双蛋白酶微球中蛋白酶的固载率为
10
％
‑
40
％，即质量占比，其中外肽酶的固载量为
0.3
‑
4.5mg/g
，內肽酶的固载量为
0.1
‑
20mg/g。
[0010]优选的，所述外肽酶为氨肽酶或羧肽酶；
[0011]所述氨肽酶为金属氨肽酶
、
半胱氨酸氨肽酶或丝氨酸氨肽酶；
[0012]所述羧肽酶为丝氨酸羧肽酶
、
金属羧肽酶
、
半胱氨酸羧肽酶或脯氨酰羧肽酶；
[0013]所述内肽酶选自脯氨酰内肽酶
、
天冬酰胺内肽酶
、
脯氨酸内肽酶
、
谷氨酰内肽酶
、
地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶
、
半胱氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶，苏氨酸蛋白酶，谷氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶
。
[0014]优选的，所述外肽酶为
Prote AXH
蛋白酶
、
二肽酶或三肽酶
。
[0015]优选的，所述金属离子选自
Cu
2+
、Fe
3+
、Ca
2+
、Zn
2+
、Ni
2+
中的一种或几种混合
。
[0016]更优选的，所述内肽酶为地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶
(Protin SD
‑
AY10)。
[0017]优选的，所述外肽酶的浓度为
0.2
‑
1.0mg/mL
，固载量
0.1
‑
6.5mg/g
，酶活性为
3.0
‑
20.0U/mg
，催化效率为
0.6
‑
1.2mL min
‑1mg
‑1；
[0018]所述内肽酶的浓度为
0.3
‑
1.0mg/mL
，固载量
0.3
‑
3.5mg/g
，酶活性为
1.0
‑
16.0U/g
，催化效率为
0.2
‑
1.0mL min
‑1mg
‑1。
[0019]由于外肽酶与金属离子配位形成内核，随着外肽酶浓度增加，纳米花微球的花瓣逐渐从松散变的紧凑及紧密，外肽酶的固载量随其浓度增加逐渐增大到峰值并保持稳定；后续加入内肽酶的固定化由于花瓣过于紧密，而内肽酶的固载量及包封量相对降低
。
[0020]且本专利技术通过创造性劳动发现总酶浓度
0.3
‑
1.0mg/mL
，且所述外肽酶与内肽酶的摩尔比为1：1‑1：5时，双酶的包封量较好，催化效果较好；尤其是总酶浓度为
0.6mg/mL
，外肽酶与内肽酶摩尔比例为1：
1.5
，可使双酶包封量达到最大，酶催化效果最好
。
[0021]本专利技术的目的之二提供一种固定化双蛋白酶微球的制备方法，包括：
[0022]1)
制备有机
‑
无机杂化外肽酶固定化介孔微球
[0023]将一定量的外肽酶添加到
PBS
缓冲溶液中搅拌混合，得到外肽酶溶液，随后向外肽酶溶液中加入一定量的金属离子，在一定温度下，静置孵育6‑
48h
，离心获得沉淀，洗涤沉淀中残留的外肽酶，即得到有机
‑
无机杂化外肽酶固定化介孔微球；
[0024]2)
固定化双蛋白酶微球的制备：
[0025]将有机
‑
无机杂化外肽酶固定化介孔微球分散于一定量的
PBS
缓冲溶液中，加入一定比例的游离态内肽酶，搅拌反应6‑
48h
，离心得到沉淀，洗涤沉淀残留的内肽酶，冷冻干燥即得到固定化双蛋白酶微球
。
[0026]优选的，包括：步骤
1)
所述金属离子在反应体系的终浓度为1‑
6mM
；所述一定温度为4‑
10℃
；
[0027]更优选的，所述金属离子的浓度为3‑
5mM
；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种固定化双蛋白酶微球，其特征在于，所述固定化双蛋白酶微球是具有介孔结构的球形颗粒，所述固定化双蛋白酶微球是通过外肽酶与金属离子配位自组装构成载体内核，内肽酶与所述载体内核上的所述金属离子配位杂化得到的
。2.
根据权利要求1所述的一种固定化双蛋白酶微球，其特征在于，所述固定化双蛋白酶微球中蛋白酶的固载率为
10
％
‑
40
％，其中外肽酶的固载量为
0.3
‑
4.5mg/g
，內肽酶的固载量为
0.1
‑
20mg/g。3.
根据权利要求2所述的一种固定化双蛋白酶微球，其特征在于，所述外肽酶为氨肽酶或羧肽酶；所述氨肽酶为金属氨肽酶
、
半胱氨酸氨肽酶或丝氨酸氨肽酶；所述羧肽酶为丝氨酸羧肽酶
、
金属羧肽酶
、
半胱氨酸羧肽酶或脯氨酰羧肽酶；所述内肽酶选自脯氨酰内肽酶
、
天冬酰胺内肽酶
、
脯氨酸内肽酶
、
谷氨酰内肽酶
、
地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶
、
半胱氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶，苏氨酸蛋白酶，谷氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶
。4.
根据权利要求2所述的一种固定化双蛋白酶微球，其特征在于，所述外肽酶为
ProteAXH
蛋白酶
、
二肽酶或三肽酶
。5.
根据权利要求1所述的一种固定化双蛋白酶微球，其特征在于，所述金属离子选自
Cu
2+
、Fe
3+
、Ca
2+
、Zn
2+
、Ni
2+
中的一种或几种混合
。6.
根据权利要求1所述的一种固定化双蛋白酶微球，其特征在于，所述固定化双蛋白酶微球的粒径在
10
‑
30
μ
m
，比表面积
10
‑
50m2/g
，孔体积为
0.1
‑
0.3cm3/g
，平均孔径为
40
‑
100nm。7.
根据权利要求2‑6任一所述的固定化双蛋白酶微球的制备方法，其特征在于，包括：
1)
制备有机
‑
无机杂化外肽酶固定化介孔微球将一定量的外肽酶添加到
PBS
缓冲溶液中搅拌混合，得到外肽酶溶液，随后向外肽酶溶液中加入一定量的金属离子，在一定温度下，静置孵育6‑
48h
，离心获得沉淀，洗涤沉淀中残留的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑明明，张逸，张羽飞，龚阳敏，万楚筠，朱昊，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：