一种包被载药脂质纳米粒的外膜囊泡及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种包被载药脂质纳米粒的外膜囊泡、制备方法及其应用，外膜囊泡由FimH阳性菌株中获得，融合C16

【技术实现步骤摘要】
一种包被载药脂质纳米粒的外膜囊泡及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于肿瘤靶向治疗
，具体涉及一种包被载药脂质纳米粒的外膜囊泡、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]巨噬细胞具有自身形态灵活、表面受体丰富、免疫原性低和循环时间长的特点，不仅具备吞噬肿瘤细胞、递呈抗原和分泌细胞因子等细胞治疗潜力，还具有吞噬载药、固有靶向和深层渗透的药物递送能力，有望成为细胞疗法及药物递送的双重工具。
[0003]近年来，纳米
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巨噬细胞药物递送系统应运而生，该系统是将纳米药物装载于活巨噬细胞内部而形成的递药体系。其核心技术在于纳米颗粒的制备，纳米颗粒的粒径、表面电荷和形状质地均能影响巨噬细胞的摄取，如果纳米颗粒摄取后进入巨噬细胞溶酶体，会引起纳米颗粒结构降解，使得纳米颗粒装载的药物以游离形式通过杀伤细胞或跨细胞膜的方式释放，严重影响肿瘤治疗效果。因此，纳米药物以何种形式装载于活巨噬细胞内部，然后又以何种形式释放，对肿瘤治疗具有重大意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术一方面提供了一种包被载药脂质纳米粒的外膜囊泡。
[0005]进一步地，包被载药脂质纳米粒之前的外膜囊泡融合C16
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神经酰胺。
[0006]进一步地，包被载药脂质纳米粒之前的外膜囊泡由FimH阳性菌株中获得。优选，MG1655菌株。
[0007]进一步地，所述载药脂质纳米粒所载的药物为R848和INCB
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024360。
[0008]R848是一种TLR7/8通路激动剂，中文名为雷西莫特，英文名为Resiquimod。
[0009]INCB
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024360是一种IDO1通路抑制剂，本专利中简称INCB。
[0010]本专利技术中重要的缩写具体的意义为：
[0011]OMV(Outer membrane vesicle，外膜囊泡，未包被脂质纳米粒)
[0012]HCC(Hepatocellular carcinoma，肝细胞癌)
[0013]RIL(共载R848和INCB脂质纳米粒)
[0014]RILO(包被共载R848和INCB脂质纳米粒的OMV)
[0015]RILOM1(载包被共载R848和INCB脂质纳米粒OMV的M1型巨噬细胞)。
[0016]巨噬细胞的功能性极化具有多样性，目前认为巨噬细胞极化是一个重叠的功能状态连续谱，拥有M1型和M2型两个极端状态以及一系列兼具M1型和M2型功能的中间状态。其中，M1型巨噬细胞高表达CD80分子，具有促炎和抗肿瘤作用；M2型巨噬细胞高表达CD206分子，具有抗炎和促肿瘤作用。我们选用的是M1型巨噬细胞进行试验。
[0017]RILOM1G(载包被共载R848和INCB脂质纳米粒OMV的G12修饰的M1型巨噬细胞)
[0018]本专利技术一方面提供了一种包被载药脂质纳米粒的外膜囊泡的制备方法，由FimH阳性菌株中获得的外膜囊泡经过C16
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神经酰胺融合，然后融合载药的脂质纳米粒。
[0019]进一步地，采用纳米沉淀法制备RIL。
[0020]具体地，1)将R848和INCB按1:1的质量比溶解在无水乙醇中，得一定药物浓度(药脂比15:100，即9mg/mL的R848和9mg/mL的INCB)的有机相。
[0021]2)将大豆卵磷脂溶于一定质量分数(0.5％)吐温
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80缓冲液中，超声溶解，得一定磷脂浓度(大豆卵磷脂浓度12mg/mL)的水相。根据实验室前期研究基础，确定水相与有机相体积比为10:1。
[0022]3)使用微量注射泵在冰浴磁力搅拌600rpm条件下以10mL/h滴加速度将有机相加入到水相中。于室温磁力搅拌400rpm条件下，搅拌1h使乙醇挥发至无醇味，使用0.22μm微孔滤膜除去游离药物，即得RIL。
[0023]进一步地，采用超高速离心法提取分离OMV。
[0024]具体地，将大肠杆菌MG1655添加到250mL LB培养基中，在37℃，200rpm条件下震荡孵育。待分光光度计测得600nm处光密度约为1.2时，取上清液在4℃、4000g条件下离心10min。经0.45μm水系微孔滤膜抽滤后，使用截留分子量为100kDa的超滤离心管在4℃、4000g条件下离心10min，得浓缩滤液50mL。使用超高速离心机在4℃、150000g条件下离心3h，将浓缩物重悬于1
×
PBS缓冲液中，于4℃、150000g条件下再次离心3h以去除OMV中杂蛋白，最后将OMV重悬于1mL 1
×
PBS缓冲液中，于
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80℃保存供进一步使用。
[0025]进一步地，采用过膜挤压法制备RILO。
[0026]具体地，将C16
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神经酰胺(450μM)加入一定浓度(400μg/mL)的OMV中，于4℃超声处理2min，得到富含C16
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神经酰胺的OMV。然后，将富含C16
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神经酰胺的OMV与新鲜制备的RIL在涡旋条件下以1:1的体积比混合，过膜(50nm)挤压数次(12次)，即得RILO。
[0027]本专利技术一方面提供了一种包被载药脂质纳米粒的外膜囊泡在制备纳米
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巨噬细胞药物递送系统中的应用。
[0028]本专利技术一方面提供了一种包被载药脂质纳米粒的外膜囊泡在制备基于活巨噬细胞的细胞疗法中的应用。
[0029]本专利技术一方面提供了一种包被载药脂质纳米粒的外膜囊泡在维持基于活巨噬细胞的细胞疗法在肿瘤微环境中抗肿瘤表型的应用。
[0030]本专利技术一方面提供了一种C16
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神经酰胺在调控纳米
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巨噬细胞药物递送系统的释药形式中的应用。
[0031]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0032]1、使用融合C16
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神经酰胺的OMV包裹共载R848和INCB的脂质纳米粒(RIL)制备包裹OMV的RIL(RILO)，RILO可通过小窝蛋白介导的内吞途径进入M1型巨噬细胞，避免溶酶体等强酸性环境对纳米药物的降解。此外，OMV中融合的C16
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神经酰胺可使载药巨噬细胞在肿瘤部位以非游离形式释放药物，释放的药物可被肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞摄取，发挥调节肿瘤相关巨噬细胞表型，持续增强T细胞活力的作用，引发强大抗肿瘤免疫反应。C16
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神经酰胺是一种锥形结构脂质，有助于支持稳定OMV的膜结构，增强OMV膜的负向曲率，起到支持稳定的作用。同时，我们研究发现C16
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神经酰胺还能促进巨噬细胞以非游离形式再次释放吞噬的药物，以非游离形式释放的药物包括以巨噬细胞释放的外泌体或微囊等胞外囊泡成分包裹药物的形式。本专利证明使用融合C16
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神经酰胺外膜囊泡(Outer membrane ves本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包被载药脂质纳米粒的外膜囊泡，其特征是，包被载药脂质纳米粒之前的外膜囊泡融合C16
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神经酰胺。2.如权利要求1所述的包被载药脂质纳米粒的外膜囊泡，其特征是，包被载药脂质纳米粒之前的外膜囊泡由FimH阳性菌株中获得。3.如权利要求1所述的包被载药脂质纳米粒的外膜囊泡，其特征是，所述载药脂质纳米粒所载的药物为R848和INCB
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024360。4.如权利要求1
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3所述的包被载药脂质纳米粒的外膜囊泡的制备方法，其特征是，由FimH阳性菌株中获得的外膜囊泡经过C16
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神经酰胺融合，然后融合载药的脂质纳米粒。5.如权利要求4所述的包被载药脂质纳米粒的外膜囊泡的制备方法，其特征是，采用纳米沉淀法制备共载R848和INCB
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024360脂质纳米粒，采用超高速离心法提取分离未包被脂质纳米粒的外膜囊泡，采用过膜挤压法制备包被共载R848和INCB脂质纳米粒的外膜...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娜，刘金虎，刘永军，高彤，牟伟伟，梁爽，黄昕研，刘暑珺，刘美辰，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：