一种检测微生物污染程度的试剂盒制造技术

本申请提供一种检测微生物污染程度的试剂盒，尤其涉及一种植物体细胞

【技术实现步骤摘要】
一种检测微生物污染程度的试剂盒


[0001]本申请涉及一种检测微生物污染程度的试剂盒，属于生物化学检测领域
。

技术介绍

[0002]传统的微生物污染程度的检测方法主要为微生物培养法和
pH
方法，其中微生物方法操作复杂，劳动强度大，对操作人员的技术水平要求高，检测速度慢
、
通常需要7‑
19
天，需要无菌操作环境；
pH
方法主要通过检测样品中
pH
的变化来判断微生物污染程度，通常需要5‑
14
天，需要无菌操作环境，另外并非所有微生物的生长繁殖都会改变
pH
，因此
pH
方法易出现假阴性结果
。
由于这些检测方法检测速度较慢，可适用于保质期较长的罐头类食品的检测，而乳制品等自动化程度较高且保质期较短的食品则不适用这样的检测方法
。
[0003]ATP
是一种能量分子，普遍存在于有机体中，
ATP
含量与微生物活细胞数量成一定正比关系
。
因此，通过检测样品中
ATP
的含量判断微生物的污染程度是一种非常有市场前景的
、
快速检测样品中微生物污染的方法
。
这种方法的步骤大体包括：首先通过
ATP
降解剂去除微生物细胞外的游离
ATP(
若是植物源性食品，要先提取植物体细胞
ATP)
；再酶解游离
ATP
和
/
或植物体细胞
ATP
；然后裂解微生物活细胞以释放出微生物活细胞内的
ATP
；再后在荧光素酶的存在下，
ATP
可与荧光素快速反应并发光；最后通过检测仪捕获
ATP
发光反应的发光信号并报告结果
。
这种方法存在的问题是：
ATP
降解酶在反应中活力不足，游离
ATP
去除不完全，微生物细胞裂解不充分，缺乏优质的反应体系，同一套检测方法对不同的样品难以均获得准确度
、
精密度
、
灵敏度俱佳的检测结果等
。
[0004]尽管
ATP
生物发光法检测微生物污染程度的原理是人们已知的，但根据该原理的改良和创新仍然非常有价值，这是因为一套完整高效的方法是由若干不同的步骤有机的
、
策略地组合在一起而实现的，而不是单独割裂地改进某个步骤
。
比如裂解细胞的方法有很多，加热裂解
、
机械裂解
、
化学裂解等，其中，采用表面活性性剂是化学裂解中的一种方式
。
表面活性剂按类别分为离子型表面活性剂
(
包括阳离子表面活性剂与阴离子表面活性剂
)、
非离子型表面活性剂
、
两性表面活性剂
、
复配表面活性剂
、
其他表面活性剂等，且人们可以不断地合成各种新的表面活性剂，因此，属于表面活性剂的化合物可能不计其数
。
然而，并不是所有的表面活性剂一概适于在任何条件下裂解细胞，在
ATP
生物发光法检测微生物污染程度的方法中，适用的表面活性剂需要考虑具备以下特点：
(1)
可快速杀死活细胞并破碎细胞膜以获得最大
ATP
的量；
(2)
使
ATP
水解酶失活并且还不能影响
ATP
的性质；
(3)
不影响或轻微影响后续检测步骤中的荧光素酶的活性
。
所有这些特点既可以通过实验直接检测，也可通过最终对
ATP
的检测效果来间接验证
。
可见，能否筛选出适于该方法的优良表面活性剂化合物是无法预料的，因而并不能被认为是常规的
。
[0005]对于植物源性样品中的微生物污染进行检测时，还需要进一步保证采用某个表面活性剂裂解植物细胞并提取植物细胞
ATP
时，该表面活性剂不会同时裂解微生物细胞，造成微生物细胞
ATP
被过早释放影响检测结果的准确性
。
因此，该表面活性剂的选择就需要更加慎重，而不能任意采用其他表面活性剂替代
。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，专利技术人联合多家科研单位共同研发，将整套
ATP
检测方法流程中的每个环节拆分开来，逐一进行改良，分工协作，再组合起来实验并调整，最终摸索出了一套高效的微生物污染程度检测方法，构建了完整的检测系统，包括试剂盒
、
检测方法及设备
。
[0007]就检测方法而言，按检测对象不同分为两类：一类是非植物源性的样品，另一类是植物源性样品
。
[0008]对于非植物源性的样品而言，检测方法包括如下步骤：样品制备；加入
ATP
降解剂降解样品中的游离
ATP
；用微生物细胞裂解剂裂解微生物活细胞以释放出微生物活细胞内的
ATP
；在荧光素酶的存在下，使
ATP
可与荧光素快速反应并发光；检测发光信号并反馈结果
。
[0009]在该方法中，主要的改进点为
①
使用三甲基甘氨酸作为微生物细胞裂解剂中的主要成分，且形成了包括十八烷基三甲基氯化铵
、
三甲基甘氨酸和
EDTA
的改良的微生物细胞裂解剂
。
②
改良了
ATP
降解剂中的
ATP
降解缓冲液，加入了
Zn
2+
离子，最终形成了包括
ZnSO4、
琥珀酸和氢氧化钠的改良的
ATP
降解缓冲液
。
[0010]对于植物源性的样品而言，检测方法包括如下步骤：样品制备；用植物细胞提取剂提取植物细胞
ATP
；加入
ATP
降解剂降解样品中游离
ATP
和植物体细胞
ATP
；用微生物细胞裂解剂裂解微生物活细胞以释放出微生物活细胞内的
ATP
；在荧光素酶的存在下，使
ATP
可与荧光素快速反应并发光；检测发光信号并反馈结果
。
[0011]在该方法中，主要的改进点除了包括上述
①
和
②
之外，还进一步包括
③
采用脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚作为植物细胞提取剂的主要成分
。
[0012]为了完整优化全套检测系统，对于上述两类方法，本申请进一步的改进点还包括
④
确定了脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚的最佳浓度
、
微生物细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括
ATP
降解酶
、ATP
降解缓冲液和微生物细胞裂解剂；所述微生物细胞裂解剂包括三甲基甘氨酸
。2.
如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述微生物细胞裂解剂包括十八烷基三甲基氯化铵
、
三甲基甘氨酸和
EDTA。3.
如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括植物细胞
ATP
提取剂；所述植物细胞
ATP
提取剂包括脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚
。4.
如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述
ATP
降解缓冲液中包括
Zn
2+
离子
。5.
如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述
ATP
降...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙飞，肖琎，杨昱萍，
申请(专利权)人：唐山市食品药品综合检验检测中心内蒙古科技大学包头师范学院，
类型：发明
国别省市：