一种肺炎克雷伯菌制造技术

本发明专利技术提供了一种肺炎克雷伯菌

【技术实现步骤摘要】
一种肺炎克雷伯菌slyA基因缺失减毒活疫苗株及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种肺炎克雷伯菌
slyA
基因缺失减毒活疫苗株及其制备方法与应用
。

技术介绍

[0002]高毒力肺炎克雷伯菌
(HvKp)
具有感染任何年龄的健康个体的能力，以及感染患者呈现多部位感染和
/
或随后发生转移性传播的倾向，从而导致传染性综合征的发生，包括非肝性脓肿
、
肺炎和坏死性筋膜炎等
。
最近，
HvKp
菌株可通过获取抗性质粒或通过将抗性元件插入其毒力质粒获得抗菌耐药基因
(CR
‑
HvKp)
，
CR
‑
HvKp
株引起的致命性爆发的报道令人高度关注，但未得到控制
。
抗生素治疗是目前一种常见的方法，鉴于
CR
‑
HvKp
不断增加，我们需要新的策略来控制和预防肺炎克雷伯菌的感染
。
接种疫苗是另一项预防传染病的关键战略，并且保留了病原菌刺激人体免疫系统的特性
。
目前基于荚膜多糖
(CPS)、
脂多糖
(LPS)
和蛋白质等，针对肺炎克雷伯菌的疫苗方案包括全细胞疫苗
、
核糖体疫苗和毒力因子
。
全细胞疫苗中的减毒疫苗可诱导体液免疫和细胞免疫，使机体获得较广泛的免疫保护，并且无需要添加佐剂，尽管生物安全问题限制了活疫苗的使用，但是它们可以扩大免疫效果，增强群体免疫屏障
。
[0003]因此，有必要开发一种可以诱导强大的体液免疫反应预防肺炎克雷伯菌感染的新疫苗
。

技术实现思路

[0004]为了解决所述技术问题，本专利技术提供了一种肺炎克雷伯菌
slyA
基因缺失减毒活疫苗株及其制备方法与应用，本专利技术的疫苗可以诱导强大的体液免疫反应
。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]在本专利技术的第一方面，提供了一种肺炎克雷伯菌
slyA
基因缺失减毒活疫苗株的制备方法，所述方法包括：
[0007]以高毒力肺炎克雷伯菌
NTUH
‑
K2044
株
DNA
为模板，分别以
SEQ ID NO.1
‑2的引物扩增获得上同源片段，以
SEQ ID NO.3
‑4的引物扩增获得下同源片段；
[0008]将所述上同源片段和所述下同源片段以
SEQ ID NO.1
和
SEQ ID NO.3
为引物进行扩增，获得同源臂融合片段；
[0009]将融合的同源臂片段连接到
T
载体后，获得含同源臂的质粒；
[0010]将含
Cas9
的质粒转入肺炎克雷伯菌
NTUH
‑
K2044
的感受态中，获得含
Cas9
肺炎克雷伯菌
NTUH
‑
K2044
感受态；
[0011]将
SEQ ID NO.9
所示的
sgRNA
和所述含同源臂的质粒转化至所述含
Cas9
肺炎克雷伯菌
NTUH
‑
K2044
感受态中，获得
Δ
slyA
缺失菌株，即肺炎克雷伯菌
slyA
基因缺失减毒活疫苗株
。
[0012]在本专利技术的第二方面，提供了所述方法制备得到的肺炎克雷伯菌
slyA
基因缺失减毒活疫苗株
。
[0013]在本专利技术的第三方面，提供了一种肺炎克雷伯菌
slyA
基因缺失减毒活疫苗，包括所述的肺炎克雷伯菌
slyA
基因缺失减毒活疫苗株以及药学上接受的佐剂
。
[0014]进一步地，所述佐剂包括氢氧化铝
、
卵磷脂
、
弗氏佐剂
、MPL TM、IL
‑
12、
氢氧化铝联合
CpG ODN
复合佐剂
、ISA51VG、ISA720VG、MF59、QS21、AS03
佐剂中的至少一种
。
[0015]在本专利技术的第四方面，提供了所述的疫苗株和
/
或所述的疫苗在制备预防人类和动物中肺炎克雷伯菌感染的疫苗中的应用
。
[0016]本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0017]本专利技术提供的一种肺炎克雷伯菌
slyA
基因缺失减毒活疫苗株及其制备方法与应用，本专利技术通过筛选获得了一种可以对抗
HvKp(
肺炎克雷伯菌
)
感染的减毒活疫苗，在构建
slyA
缺失菌株后，通过研究
Δ
slyA
菌株作为减毒活疫苗的保护效果，发现
Δ
slyA
菌株可以诱导强大的体液免疫反应，并提供对
HvKp
感染的保护
。
我们发现
Δ
slyA
菌株可作为一种新的候选疫苗的潜力，以及对肺炎克雷伯菌感染的抵抗能力
。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图
。
[0019]图1为
slyA
上同源臂
(UP)
和下同源臂
(down)(
注：
M
为
DL 2000 marker)
；
[0020]图2为上下同源臂融合片段；
[0021]图3为重组质粒接
pUX
‑
T
‑
slyA
的
PCR
筛选和鉴定；注：1‑
12
为平板上随机挑取的
12
个克隆编号；
[0022]图
4(A)slyA
‑
JD
‑
F/R
扩增敲除菌与野生菌
。(B)slyA
‑
ter
‑
F/R
扩增敲除菌与野生菌
。
注：图中1指
Δ
slyA
菌株，2指野生
K2044
菌；
[0023]图5为接种
106CFU
浓度
Δ...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种肺炎克雷伯菌
slyA
基因缺失减毒活疫苗株的制备方法，其特征在于，所述方法包括：以肺炎克雷伯菌
NTUH
‑
K2044
的
DNA
为模板，分别以
SEQ ID NO.1
‑2的引物扩增获得上同源片段，以
SEQ ID NO.3
‑4的引物扩增获得下同源片段；将所述上同源片段和所述下同源片段以
SEQ ID NO.1
和
SEQ ID NO.3
为引物进行扩增，获得同源臂融合片段；将融合的同源臂片段连接到
T
载体后，获得含同源臂的质粒；将含
Cas9
的质粒转入肺炎克雷伯菌
NTUH
‑
K2044
的感受态中，获得含
Cas9
肺炎克雷伯菌
NTUH
‑
K2044
感受态；将
SEQ ID NO.9
所示的
sgRNA
和所述含同源臂的质粒转化至所述含
Cas9
肺炎克雷伯菌
NTUH

【专利技术属性】
技术研发人员：周英顺，梁清华，罗金晶，候小峰，胡仁静，
申请(专利权)人：西南医科大学，
类型：发明
国别省市：