高产G418的棘孢小单孢菌制造技术

本发明专利技术提出一株高产G418的棘孢小单孢菌，具体地，本发明专利技术提出了两种微生物，其分别为棘孢小单孢菌YC101

【技术实现步骤摘要】
高产G418的棘孢小单孢菌


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体地，本专利技术涉及高产G418的棘孢小单孢菌及构建策略。

技术介绍

[0002]G418又称Geneticin，是由红橙小单孢菌(Micromonospora rhodorangea)产生的含有2
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脱氧链霉胺核心结构的天然氨基糖苷类抗生素。在分子遗传学中，G418是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。近年来，G418还被广泛应用于去除细胞培养中沾染的成纤维细胞。最新研究报道，G418及其衍生物可以用于治疗无义突变引起的人类遗传性疾病以及具有抑制病毒功效。
[0003]天然合成G418的红橙小单孢菌代谢产物复杂且化学结构相近，理化性质相似，导致生产G418成本高，层析分离周期长，收率低，料耗大，污染严重，提取精制工艺复杂，而且产品质量不稳定，与G418结构相似的副产物随时出现干扰，给G418产品质量控制造成了极大的不确定性，严重影响了药品的稳定性、安全性和有效性，是迫切需要解决的科学难题。
[0004]因此获得G418产物单一且具有明显产量优势的菌株将具备巨大的工业应用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
[0006]在棘孢小单孢菌中，G418是庆大霉素生物合成过程中的中间体，2014年，文献Ni X,Sun Z,Zhang H,He H,Ji Z,Xia H.Genetic engineering combined with random mutagenesis to enhance G418 production in Micromonospora echinospora.J Ind Microbiol Biotechnol.2014Sep；41(9):1383
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90.doi:10.1007/s10295
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014
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1479
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3.Epub 2014Jul 17.PMID:25031027中通过一步敲除下游途径基因genQ获得了G418单组分合成菌株，产量达到680
±
31mg/L。但仍满足不了目前工业生产的需求。因此，专利技术人经过大量的实验，筛选得到了两种棘孢小单孢菌菌株，分别为棘孢小单孢菌YC101
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2和棘孢小单孢菌YC101
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4，两种菌株生产G418的量分别达到了2026mg/L和2728mg/L，远远超过现有菌株生产G418的量，因此具备巨大的工业应用价值。
[0007]因此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种微生物。根据本专利技术的实施例，所述微生物为棘孢小单孢菌YC101
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2 Micromonospora echinospora YC101
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2，于2023年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20231293，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
[0008]在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种微生物，其为棘孢小单孢菌YC101
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4Micromonospora echinospora YC101
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4，于2023年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20231294，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
[0009]专利技术人为了获得能够生产G418的微生物而进行了大量的理论分析和实验筛选，考虑到各个地方的土壤环境的不同，收集了不同地区的土壤，对其中的菌株进行分离纯化，初
筛到一株与棘孢小单孢菌的16s rRNA相似度达到99.6％的菌株。然后专利技术人通过genQ基因敲除得到了一株能够主产G418的YC101菌株。为了获得能够高产G418的菌株，专利技术人对YC101菌株进行压力筛选实验，最后得到了两株能够高产G418的棘孢小单孢菌YC101
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2和棘孢小单孢菌YC101
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4，为后续抗性筛选试剂G418硫酸盐的工业化生产奠定了基础，此外菌株的产量优势将大大降低产品的生产成本，提高产品市场竞争力，具备一定的工业应用价值。
[0010]在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种微生物菌剂。根据本专利技术的实施例，所述微生物菌剂含有第一方面和第二方面所述的微生物的至少之一。由此，根据本专利技术实施例的微生物菌剂能够高产G418，为后续抗性筛选试剂的制备奠定了基础。
[0011]在本专利技术的第四方面，本专利技术提出了一种制备G418的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将第一方面和第二方面所述的微生物的至少之一进行发酵处理，得到所述G418。采用本专利技术所述的方法制备G418，能够一次性制备得到大量G418，进一步满足工业生产的需求，同时，降低产品生产成本，提高产品市场竞争力。
[0012]根据本专利技术的实施例，所述方法进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
[0013]根据本专利技术的实施例，所述发酵处理包括：将第一方面和第二方面所述的微生物的至少之一在第一培养基中进行第一培养处理，得到第一产物；将所述第一产物与无菌水进行混合处理，得到第一混合液；将所述第一混合液在第二培养基中进行第二培养处理，得到第二产物；将所述第二产物在第三培养基中进行第三培养处理，得到含有所述G418的发酵液。因此，采用所述发酵处理能够使微生物扩大生长，使发酵产物中的活菌数升高，达到适宜的G418生产状态，从而提高生产G418的能力。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述第一培养基包括水和第一添加物，所述第一添加物包括可溶性淀粉、硝酸钾、磷酸氢二钾、氯化钠、碳酸钙、天冬酰胺、琼脂条和麸皮。由此，能够有助于微生物进行培养，扩大生长，为后续能够高产G418奠定了基础。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述可溶性淀粉在所述第一培养基中的质量体积分数为0.5％～1.5％。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述硝酸钾在所述第一培养基中的质量体积分数为0.1％～0.3％。
[0017]根据本专利技术的实施例，所述磷酸氢二钾在所述第一培养基中的质量体积分数为0.04％～0.08％。
[0018]根据本专利技术的实施例，所述氯化钠在所述第一培养基中的质量体积分数为0.03％～0.07％。
[0019]根据本专利技术的实施例，所述碳酸钙在所述第一培养基中的质量体积分数为0.05％～0.15％。
[0020]根据本专利技术的实施例，所述天冬酰胺在所述第一培养基中的质量体积分数为0.001％～0.003％。
[0021]根据本专利技术的实施例，所述琼脂条在所述第一培养基中的质量体积分数为1～2％。
[0022]根据本专利技术的实施例，所述麸皮在所述第一培养基中的质量体积分数为1％～3％。
[0023]根据本专利技术的实施例，所述第一培养处理的培养温度为36～38℃。
[0024]根据本专利技术的实施例，所述第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微生物，其为棘孢小单孢菌YC101
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2 Micromonospora echinospora YC101
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2，于2023年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20231293。2.一种微生物，其为棘孢小单孢菌YC101
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4 Micromonospora echinospora YC101
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4，于2023年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20231294。3.一种微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1和2所述的微生物的至少之一。4.一种制备G418的方法，其特征在于，将权利要求1和2所述的微生物的至少之一进行发酵处理，得到所述G418。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵处理包括：将权利要求1和2所述的微生物的至少之一在第一培养基中进行第一培养处理，得到第一产物；将所述第一产物与无菌水进行混合处理，得到第一混合液；将所述第一混合液在第二培养基中进行第二培养处理，得到第二产物；将所述第二产物在第三培养基中进行第三培养处理，得到所述G418。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一培养基包括水和第一添加物，所述第一添加物包括可溶性淀粉、硝酸钾、磷酸氢二钾、氯化钠、碳酸钙、天冬酰胺、琼脂条和麸皮；任选地，所述可溶性淀粉在所述第一培养基中的质量体积分数为0.5％～1.5％；任选地，所述硝酸钾在所述第一培养基中的质量体积分数为0.1％～0.3％；任选地，所述磷酸氢二钾在所述第一培养基中的质量体积分数为0.04％～0.08％；任选地，所述氯化钠在所述第一培养基中的质量体积分数为0.03％～0.07％；任选地，所述碳酸钙在所述第一培养基中的质量体积分数为0.05％～0.15％；任选地，所述天冬酰胺在所述第一培养基中的质量体积分数为0.001％～0.003％；任选地，所述琼脂条在所述第一培养基中的质量体积分数为1％～2％；任选地，所述麸皮在所述第一培养基中的质量体积分数为1％～3％；任选地，所述第一培养处理的培养温度为36～38℃；任选地，所述第一培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：常莹莹，
申请(专利权)人：武汉合生科技有限公司，
类型：发明
国别省市：