miR-99b-5p/PCSK9在制备修复子宫内膜损伤的产品中的应用制造技术

本发明专利技术提供了miR

【技术实现步骤摘要】
miR
‑
99b
‑
5p/PCSK9在制备修复子宫内膜损伤的产品中的应用


[0001]本专利技术涉及miRNA
，涉及miR
‑
99b
‑
5p/PCSK9在制备修复子宫内膜损伤的产品中的应用。

技术介绍

[0002]子宫内膜损伤是指因外界因素导致子宫内膜基层受损，失去了修复功能，表现为反复流产、月经减少、闭经、胎盘增生等，严重影响怀孕。
[0003]子宫内膜损伤原因主要有：
[0004]1、内分泌严重失调，体内激素失衡，使子宫内膜周期性变化紊乱，导致子宫内膜损伤。
[0005]2、炎症感染，如子宫腔内感染炎症，长期炎症破坏，可损伤子宫内膜，最终影响女性怀孕。
[0006]3、人工流产是子宫内膜损伤的最主要因素，多次药流、人流可能引起子宫内膜损伤。
[0007]目前对子宫内膜损伤的治疗方法分为药物治疗，物理治疗和宫腔镜手术治疗。其中药物治疗常见有大剂量口服或阴道用雌激素，皮下注射生长激素，口服阿司匹林或西地那非改善子宫内膜血供。当内膜纤维化严重，患者迫切希望治疗内膜损伤造成的不孕，恢复正常月经，宫腔镜手术是目前的首选治疗方法。但仍有大量患者接受上述治疗后仍然未能改善。故而子宫内膜损伤仍然是生殖领域的研究热点。

技术实现思路

[0008]本专利技术旨在提供miR
‑
99b
‑
5p/PCSK9在制备修复子宫内膜损伤的产品中的应用，为修复损伤的子宫内膜提供了新的方向。
[0009]本专利技术为实现上述目的，采用的技术方案为：
[0010]miR
‑
99b
‑
5p/PCSK9在制备修复子宫内膜损伤的产品中的应用。
[0011]优选地，miR
‑
99b
‑
5p的来源为骨髓间充质干细胞外泌体。
[0012]优选地，所述产品通过提高所述miR
‑
99b
‑
5p的表达水平，抑制子宫内膜基质细胞的凋亡来修复子宫内膜损伤。
[0013]优选地，所述产品通过干扰所述PCSK9，抑制子宫内膜基质细胞的凋亡来修复子宫内膜损伤。
[0014]优选地，PCSK9为miR
‑
99b
‑
5p的分子靶点，miR
‑
99b
‑
5p与PCSK9存在互作关系。
[0015]优选地，提高所述miR
‑
99b
‑
5p的表达水平时，Caspase3、Caspase9、BAX、LC3Ⅰ/Ⅱ、PCSK9、Beclin
‑
1的蛋白表达显著下降。
[0016]优选地，所述产品包括药物。
[0017]本专利技术的有益效果在于：
[0018]本专利技术将提取到的骨髓间充质干细胞外泌体进行miRNA高通量测序，根据富集分
析结果选择miR
‑
99b
‑
5p进行后续实验，发现PCSK9可能是miR
‑
99b
‑
5p的分子靶点，进而构建了PCSK9的过表达和干扰载体、miR
‑
99b
‑
5p的mimic、inhibitor，证实了骨髓间充质干细胞外泌体通过miR
‑
99b
‑
5p/PCSK9修复受损的子宫内膜基质细胞且miR
‑
99b
‑
5p与PCSK9存在互作关系。
附图说明
[0019]图1为本专利技术实施例中的细胞鉴定图，A为流式检测CD29、CD44、CD34、CD45的表达；B为免疫荧光检测Vimentin和Cytokeratin7的表达。
[0020]图2为本专利技术实施例中透射电镜观察外泌体形态图。
[0021]图3为本专利技术实施例中外泌体粒径图。
[0022]图4为本专利技术实施例中外泌体浓度图。
[0023]图5为本专利技术实施例中纳米流式鉴定CD9、CD63的表达。
[0024]图6为本专利技术实施例中miRNA转录组学测序的流程图。
[0025]图7为本专利技术实施例中mRNA转录组学测序的流程图。
[0026]图8为本专利技术实施例中载体构建验证结果，A为WB验证载体转染；B为qPCR验证载体转染；C为qPCR验证mimic/inhibitor转染(*代表与NC相比；P＜0.05)。
[0027]图9为本专利技术实施例中流式检测凋亡情况，A为调控miR
‑
99b
‑
5p的凋亡结果，B为调控PCSK9的凋亡结果(*代表与mimic
‑
NC/OE
‑
NC相比，#代表与inhibitor
‑
NC/SiRNA
‑
NC相比；P＜0.05)。
[0028]图10为不同实验组的Annexin V
‑
FITC流式细胞检测结果。
[0029]图11为本专利技术实施例中WB检测凋亡与自噬蛋白表达情况，A为调控miR
‑
99b
‑
5p的检测结果，B为调控PCSK9的检测结果(*代表与mimic
‑
NC/OE
‑
NC相比，#代表与inhibitor
‑
NC/SiRNA
‑
NC相比；P＜0.05)。
[0030]图12为本专利技术实施例中双荧光素酶活性(*代表与NC相比；P＜0.05)。
具体实施方式
[0031]为了更清楚地说明本专利技术，下面结合实施例并对照附图对本专利技术作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。
[0032]实施例
[0033]以下方法步骤中，如未有特殊说明，所用试剂及方法均为本领域常规试剂与方法，本申请不做具体限定。
[0034]统计学处理用Graphpad Prism7软件进行图形绘制和数据统计分析，每组实验均至少重复3次，以P＜0.05作为显著性差异。WB实验的条带图灰度值分析采用ImageJ软件。一、MSCs和HESCs细胞培养与鉴定
[0035]1.1细胞培养处理
[0036]人子宫内膜基质细胞(CP
‑
H208，Procell)；人原代骨髓间充质干细胞(HUM
‑
iCell
‑
s011，赛百慷)，分别用人子宫内膜基质细胞完全培养基(CM
‑
H208，Procell)和完全MEM培养基(KGM41500S，凯基生物)在37℃5％CO2培养箱中进行培养。
[0037]1.2鉴定
[0038]采用流式检测人原代骨髓间充质干细胞(MSCs)表面标志物CD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.miR
‑
99b
‑
5p/PCSK9在制备修复子宫内膜损伤的产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR
‑
99b
‑
5p的来源为骨髓间充质干细胞外泌体。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过提高所述miR
‑
99b
‑
5p的表达水平，抑制子宫内膜基质细胞的凋亡来修复子宫内膜损伤。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过干扰所述PCSK9，抑制子宫内膜基质细胞的凋亡来修复子宫内膜损伤。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：江斌，熊忠贤，
申请(专利权)人：江西中洪博元生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：