一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法技术

本发明专利技术涉及免疫检测技术领域，公开了一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，包括以下步骤，步骤一：稀释包被抗原，包被在酶标板微孔内孵孕过夜，步骤二：加入100ul的甲基嘧啶磷样品液和100ul封闭液，封闭，步骤三：弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗板三次；步骤四：稀释待检抗体，加入100ul稀释后的待检抗体孵孕，洗板三次，步骤五：加入100ul酶标二抗孵孕，步骤六：加入100ul显色液进行室温避光显色，随后加入终止液终止反应；步骤七：读取吸光度值，换算甲基嘧啶磷的实际含量。本发明专利技术通过采用2

【技术实现步骤摘要】
一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法


[0001]本专利技术涉及免疫检测
，具体为一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法。

技术介绍

[0002]甲基嘧啶磷又称安得利，分子量为305，黄色液体，可被强酸强碱水解，遇光不稳定，能溶于大多数有机溶剂，在水中溶解度约为5mg/L，是低毒(LD50为2050mg/kg)、高效(粮食仓贮的使用剂量为8ppm)、低残留杀虫剂，是联合国粮农组织(FAO)极力推荐的粮食仓贮农药品种，并在发达国家作为家庭卫生用药使用。
[0003]目前，对于甲基嘧啶磷的检测，主要采用气相色谱法、气相色谱
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质谱法、高效液相色谱法、液相色谱
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质谱法等仪器法进行定量检测，这些方法虽然存在检测结果准确可信的优势但也存在样品前处理繁琐、耗时、昂贵、不适合现场检测等缺点，而常规的利用抗体抗原的间接检测法，会将甲基嘧啶磷中甲基氯化物的水解，导致反应体系碱度过大，使甲基嘧啶磷分解，检测灵敏度和精度降低，难以满足检测需求。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，解决了现有检测方法繁琐、耗时、昂贵和检测灵敏度和精度低的问题。
[0005]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，包括以下步骤：
[0006]步骤一：将包被抗原用包被液稀释，包被在聚苯乙烯酶标板的微孔内，每孔100ul，在4℃条件下孵孕过夜；
[0007]步骤二：弃去包被液，在酶标板微孔内加入100ul的甲基嘧啶磷样品液和100ul封闭液，封闭；
[0008]步骤三：弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗板三次；
[0009]步骤四：利用稀释液稀释待检抗体，在酶标板的每孔内加入100ul稀释后的待检抗体孵孕，洗板三次；
[0010]步骤五：在酶标板每孔内加入100ul酶标二抗孵孕；
[0011]步骤六：在酶标板每孔内加入100ul显色液进行室温避光显色，随后加入终止液终止反应；
[0012]步骤七：利用酶标仪读取吸光度值，根据颜色反应程度进行包被抗原的定性和定量测定，换算甲基嘧啶磷的实际含量。
[0013]优选的，所述步骤一中包被抗原为2
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二乙氨基
‑6‑
甲基
‑4‑
羟基嘧啶醇偶联小鼠血清蛋白，所述包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，所述稀释比例为1：5000。
[0014]优选的，所述2
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二乙氨基
‑6‑
甲基
‑4‑
羟基嘧啶醇的制备方法为将硝酸二乙胍、乙醇和氢氧化钾加入反应釜中，室温下搅拌2h进行反应，产物过滤，滤液脱溶，釜底残留物为
二乙胍，随后加入甲苯、乙酰乙酸乙酯，再回流反应1
‑
2h，反应结束后脱去溶剂，得到2
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二乙氨基
‑6‑
甲基
‑4‑
羟基嘧啶醇，所述硝酸二乙胍、乙醇、氢氧化钾、甲苯和乙酰乙酸乙酯按质量份数的组份比为1：1.5：0.4：1.7：2.2。
[0015]优选的，所述步骤二中封闭液为浓度5％的脱脂奶粉，所述封闭温度为37℃，封闭时间为20min。
[0016]优选的，所述步骤三中洗涤缓冲液为PSB与0.1％浓度的吐温20混合液。
[0017]优选的，所述步骤四中稀释液为PSB与去离子水的混合液，pH值为7.4，所述稀释比例为1：5000，所述待检抗体为兔抗小鼠IgG，所述孵孕时间为20min，孵孕为温度37℃。
[0018]优选的，所述步骤五中酶标二抗为HRP驴抗兔IgG血清，所述孵孕时间为20min，孵孕为温度37℃。
[0019]本专利技术提供了一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法。具备以下有益效果：
[0020]本专利技术采用2
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二乙基氨基
‑6‑
甲基
‑4‑
羟基嘧啶醇偶联小鼠血清蛋白作为包被抗原，可以避免甲基嘧啶磷中甲基氯化物的水解，降低了反应体系的碱度，减少了甲基嘧啶磷分解，从而提高检测灵敏度和精度，同时采用兔抗小鼠IgG作为待检抗体，HRP驴抗兔IgG血清作为酶标二抗，操作简单，成本低廉，适合大规模检测实验，更好地满足检测需求。
具体实施方式
[0021]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0022]实施例：
[0023]本专利技术实施例提供一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，包括以下步骤：
[0024]步骤一：将包被抗原用包被液稀释，包被在聚苯乙烯酶标板的微孔内，每孔100ul，在4℃条件下孵孕过夜；
[0025]步骤二：弃去包被液，在酶标板微孔内加入100ul的甲基嘧啶磷样品液和100ul封闭液，封闭；
[0026]步骤三：弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗板三次；
[0027]步骤四：利用稀释液稀释待检抗体，在酶标板的每孔内加入100ul稀释后的待检抗体孵孕，洗板三次；
[0028]步骤五：在酶标板每孔内加入100ul酶标二抗孵孕；
[0029]步骤六：在酶标板每孔内加入100ul显色液进行室温避光显色，随后加入终止液终止反应；
[0030]步骤七：利用酶标仪读取吸光度值，根据颜色反应程度进行包被抗原的定性和定量测定，换算甲基嘧啶磷的实际含量。
[0031]进一步的，步骤一中包被抗原为2
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二乙氨基
‑6‑
甲基
‑4‑
羟基嘧啶醇偶联小鼠血清蛋白，包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，稀释比例为1：5000。
[0032]进一步的，2
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二乙氨基
‑6‑
甲基
‑4‑
羟基嘧啶醇的制备方法为将硝酸二乙胍、乙醇和氢氧化钾加入反应釜中，室温下搅拌2h进行反应，产物过滤，滤液脱溶，釜底残留物为二乙胍，随后加入甲苯、乙酰乙酸乙酯，再回流反应1
‑
2h，反应结束后脱去溶剂，得到2
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二乙氨基
‑6‑
甲基
‑4‑
羟基嘧啶醇，硝酸二乙胍、乙醇、氢氧化钾、甲苯和乙酰乙酸乙酯按质量份数的组份比为1：1.5：0.4：1.7：2.2。
[0033]进一步的，步骤二中封闭液为浓度5％的脱脂奶粉，封闭温度为37℃，封闭时间为20min。
[0034]具体的，封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程，抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将包被抗原用包被液稀释，包被在聚苯乙烯酶标板的微孔内，每孔100ul，在4℃条件下孵孕过夜；步骤二：弃去包被液，在酶标板微孔内加入100ul的甲基嘧啶磷样品液和100ul封闭液，封闭；步骤三：弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗板三次；步骤四：利用稀释液稀释待检抗体，在酶标板的微孔内加入100ul稀释后的待检抗体孵孕，洗板三次；步骤五：在酶标板微孔内加入100ul酶标二抗孵孕；步骤六：在酶标板微孔内加入100ul显色液进行室温避光显色，随后加入终止液终止反应；步骤七：利用酶标仪读取吸光度值，根据颜色反应程度进行包被抗原的定性和定量测定，换算甲基嘧啶磷的实际含量。2.根据权利要求1所述的一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，所述步骤一中包被抗原为2
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二乙氨基
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甲基
‑4‑
羟基嘧啶醇偶联小鼠血清蛋白，所述包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，所述稀释比例为1:5000。3.根据权利要求2所述的一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，所述2
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二乙氨基
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甲基
‑4‑
羟基嘧啶醇的制备方法为将硝酸二乙胍、乙醇和氢氧化钾加入反应釜中，室温下搅拌2h进行反应，产物过滤，滤液脱溶，釜底残留物为二乙胍，随后...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘仁智，汪爱春，毛林生，朱孝卫，乐红卫，邵剑，丁开良，李龙水，吴锋，叶小华，
申请(专利权)人：海利贵溪新材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：