大鼠无细胞原位牙髓再生模型构建方法技术

本发明专利技术涉及无细胞牙髓再生大鼠模型技术领域，尤其涉及一种大鼠无细胞原位牙髓再生模型构建方法，包括：步骤1：以实验室已经去除牙髓后的大鼠作为试验对象，3日后，将大鼠分为实验组和对照组，分别用15和20号K锉清理预备根管，0.25％次氯酸钠及生理盐水交替冲洗，吸潮纸尖干燥根管；步骤2：实验组空根管内注射前提制备的预冷的SHED

【技术实现步骤摘要】
大鼠无细胞原位牙髓再生模型构建方法


[0001]本专利技术涉及无细胞牙髓再生大鼠模型
，尤其涉及一种大鼠无细胞原位牙髓再生模型构建方法。

技术介绍

[0002]目前已报道的原位牙髓再生多在大型动物如小型猪、比格犬牙齿上实现，由于大型动物存在信号干预、基因标记和细胞示踪等技术上的瓶颈，而裸鼠皮下异位移植实现的异位牙髓再生不能完全模拟体内牙髓再生的真实情况，因此，目前仍缺乏便于机制研究的原位牙髓再生模型。
[0003]前期研究已在小型猪和裸鼠皮下证实乳牙牙髓干细胞能够实现良好牙髓再生，但由于缺乏合适的原位牙髓再生动物模型，其具体机制尚不清楚，SHED
‑
EVs在组织再生中具有重要作用，但在原位牙髓再生中的作用尚不明确，因此，构建大鼠牙髓再生模型有利于进一步探讨SHED
‑
EVs诱导牙髓再生的相关机制。
[0004]综上所示，目前牙髓再生模型存在以下缺陷：
[0005]1、大动物原位牙髓再生模型成本高，且难以进行分子机制研究。
[0006]2、裸鼠皮下异位移植实现的异位牙髓再生不能完全模拟体内牙髓再生的真实情况。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种研究SHED
‑
EVs诱导原位牙髓再生的动物模型，降低研究成本。
[0008]本专利技术所采取的技术方案：
[0009]大鼠无细胞原位牙髓再生模型构建方法，包括以下步骤：
[0010]步骤1：以实验室已经去除牙髓后的大鼠作为试验对象，3日后，将大鼠分为实验组和对照组，分别用15和20号K锉清理预备根管，0.25％次氯酸钠及生理盐水交替冲洗，吸潮纸尖干燥根管；
[0011]步骤2：实验组空根管内注射前提制备的预冷的SHED
‑
EVs凝胶，使其充满根管；对照组注射等量的SHED
‑
EVs的空白凝胶，隔湿静置10min，待凝胶变胶状后，iRoot BP封闭开髓孔；
[0012]步骤3：大鼠苏醒后常规条件下饲养4周，按150mg/kg标准腹腔注射过量麻药处死大鼠，收集右侧上颌骨，4％多聚甲醛固定24h，17％EDTA脱钙液每日换液，脱钙4周；
[0013]步骤:4：石蜡包埋后切片，进行苏木素
‑
伊红染色，观察实验组和对照组根管内组织学结构。
[0014]作为本专利技术的进一步优化，预冷的SHED
‑
EVs凝胶的制备过程如下：
[0015]步骤201：分离培养SHED
[0016]获取临床患儿乳牙牙髓，采用胶原酶消化法分离培养SHED；
[0017]步骤202：SHED
‑
EVs提取与鉴定；
[0018]步骤203：制备SHED
‑
EVs凝胶。
[0019]作为本专利技术的更进一步优化，步骤201的具体过程如下：
[0020](1)收集来自临床患儿脱落乳牙的牙髓组织；
[0021](2)在超净台内用PBS缓冲液反复冲洗牙髓组织，而后使用无菌器械将组织剪碎成1mm3大小组织块；
[0022](3)组织块中加胶原酶5mL，轻柔吹匀组织块后收集入15mL离心管中，37℃孵箱中90min充分消化组织；
[0023](4)待组织转变为絮状物后，向离心管中加入适量胎牛血清浓度10％的α
‑
MEM培养基停止消化，高速冷冻离心机800g、5min离心后弃上清；
[0024](5)用胎牛血清浓度10％的α
‑
MEM培养基重悬细胞沉淀，于25cm2培养瓶中接种细胞，并补充适量培养基，摇匀后置于37℃、5％CO2条件下进行培养，每3天换液1次，待细胞融合度达90％后进行传代。
[0025]作为本专利技术的进一步优化，步骤202的具体过程如下：
[0026](1)将P4代SHED按照2
×
10^5/mL的密度接种在直径150mm细胞培养皿，使用10％去囊泡胎牛血清的α
‑
MEM培养基，继续培养48h；
[0027](2)收集培养皿中的细胞上清液于15mL离心管中，4℃，800g，10min；
[0028](3)将离心后获得的上清液分装到1.5mL离心管中，1.5mL/管；
[0029](4)提前将高速冷冻离心机内温度降至4℃，按统一方向放入离心管，16000g，30min后可见管壁针尖大小沉淀；
[0030](5)用移液枪吸去上清，择一离心管，在管内加入1mLPBS，依次吹打重悬所有的离心管内沉淀，收集至一管内，再次离心4℃16000g，30min；
[0031](6)用移液枪吸去上清，加入200μLPBS吹打重悬，放4℃保存，第二天做透射电子显微镜观察所得细胞外囊泡形态。
[0032]作为本专利技术的更进一步优化，步骤203的具体过程如下：
[0033](1)采用BSA蛋白定量分析检测SHED
‑
EVs浓度，可提取出20ugSHED
‑
EVs/皿；
[0034](2)4℃条件下，用无菌PBS将SHED
‑
EVs重悬至0.2mg/mL，按照0.35g/ml加入温控藻酸盐生物凝胶，同时按照同样的剂量制备PBS凝胶；
[0035](3)将SHED
‑
EVs凝胶装载于微量注射器中，4℃冷藏待用。
[0036]作为本专利技术的更进一步优化，步骤2中SHED
‑
EVs凝胶的注射量为200uL。
[0037]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
[0038]1、本专利技术构建的大鼠无细胞原位牙髓再生模型，能够最大限度模拟人类牙髓再生过程，为SHED
‑
EVs的进一步研究提供了可靠的动物模型。
[0039]2、原位牙髓再生的常见动物模型为小型猪和比格犬等大动物，本技术通过构建大鼠磨牙牙髓再生模型，能够低成本实现在大动物体内难以实现的分子机制研究。
[0040]3、选择SD大鼠作为研究对象，实验动物易获得，饲养成本低，大大降低了牙髓再生体内动物实验的研究成本。
附图说明
[0041]图1为口内模型构建示意图；
[0042]图2为HE染色示牙髓再生4周后SHED
‑
EVs凝胶处理后再生牙髓组织类似正常牙髓形态；
[0043]图3(a)透射电子显微镜(TEM)观察所得细胞外囊泡形态；
[0044]图3(b)纳米颗粒示踪分析(NTA)明确所提取SHED
‑
EVs的粒径大小在100
‑
300nm。
具体实施方式
[0045]下面结合附图对本专利技术进行详细说明！
[0046]如图1所示，大鼠无细胞原位牙髓再生模型构建方法，包括以下步骤：
[0047]步骤1：以实验室已经去除牙髓后的大鼠作为试验对象(图1(a)去髓后的大本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.大鼠无细胞原位牙髓再生模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：以实验室已经去除牙髓后的大鼠作为试验对象，3日后，将大鼠分为实验组和对照组，分别用15和20号K锉清理预备根管，0.25％次氯酸钠及生理盐水交替冲洗，吸潮纸尖干燥根管；步骤2：实验组空根管内注射前提制备的预冷的SHED
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EVs凝胶，使其充满根管；对照组注射等量的SHED
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EVs的空白凝胶，隔湿静置10min，待凝胶变胶状后，iRoot BP封闭开髓孔；步骤3：大鼠苏醒后常规条件下饲养4周，按150mg/kg标准腹腔注射过量麻药处死大鼠，收集右侧上颌骨，4％多聚甲醛固定24h，17％EDTA脱钙液每日换液，脱钙4周；步骤:4：石蜡包埋后切片，进行苏木素
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伊红染色，观察实验组和对照组根管内组织学结构。2.根据权利要求1所述的大鼠无细胞原位牙髓再生模型构建方法，其特征在于，预冷的SHED
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EVs凝胶的制备过程如下：步骤201：分离培养SHED获取临床患儿乳牙牙髓，采用胶原酶消化法分离培养SHED；步骤202：SHED
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EVs提取与鉴定；步骤203：制备SHED
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EVs凝胶。3.根据权利要求2所述的大鼠无细胞原位牙髓再生模型构建方法，其特征在于，步骤201的具体过程如下：(1)收集来自临床患儿脱落乳牙的牙髓组织；(2)在超净台内用PBS缓冲液反复冲洗牙髓组织，而后使用无菌器械将组织剪碎成1mm3大小组织块；(3)组织块中加胶原酶5mL，轻柔吹匀组织块后收集入15mL离心管中，37℃孵箱中90min充分消化组织；(4)待组织转变为絮状物后，向离心管中加入适量胎牛血清浓度10％的α
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MEM培养基停止消化，高速冷冻离心机800g、5min离心后弃上清；(5)用胎牛血清浓度10％的α
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【专利技术属性】
技术研发人员：轩昆，郭皓，刘安琪，范思远，郭晓贺，黄晓瑶，刘培胜，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：