一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法技术

本发明专利技术涉及一种DNA自组装技术，特别涉及一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法。本发明专利技术通过将发卡中有引发泄漏嫌疑的toehold片段部分移除，并将其移动至输入链中，只有当输入链被输入体系时，缺失的部分再次完整，以保证甚至提升催化反应速率，达到保证催化反应动力学的基础上降低泄露反应速率的效果，最大限度提高催化发卡自组装系统的信噪比与反应性。本发明专利技术提出的自组装系统具有高效性、简便性、鲁棒性，在临床诊断、生物成像、纳米机器人等领域具有良好的应用前景。等领域具有良好的应用前景。等领域具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法


[0001]本专利技术属于动态DNA纳米
，特别涉及一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法。

技术介绍

[0002]沃森
‑
克里克碱基配对的自然性质使DNA成为一种强大而独特的工程材料，具有理想的生物相容性、高可预测性和纳米级可控性。基于toehold介导链置换反应的核酸电路是动态DNA系统构建的基础，在计算、纳米技术和诊断方面产生了许多有用的方法。其中无酶、高效、等温的催化发夹组装法(CHA)是一个典型的例子。CHA电路已被应用于多种方面，如生物传感、生物成像、纳米机器人和逻辑电路等。
[0003]实现这种无酶放大器的主要障碍包括在没有入侵链的情况下误触发扩增级联(也称为电路泄漏)，这限制了更复杂、可扩展和敏感工具的工程设计。总泄漏是由于亚稳态和平衡态之间的能量势垒不足而发生的，可分为初始泄漏和渐近泄漏。初始泄露主要来源于合成错误或者反应中错误折叠的DNA分子，可以通过精心地设计来减少反应物非目标构象或使用高度纯化的DNA链来降低；而渐进泄露主要由于DNA底物自发的瞬时构象变化，底物之间可以从双链末端或同轴末端堆叠处发生无toehold的链置换反应，引发自组装循环。
[0004]近年来，多种设计方式已被用于减少泄露反应，例如“DNA钳”、锁核酸底物、四向分支迁移和错配结构域等，也有研究团队提出了发夹的设计原则和纯化方法，以尽量减少催化发夹组件(CHA)系统中的泄漏。这些设计本质上都是通过提升泄露途径能量势垒减少泄露反应，虽然被证明在减少由呼吸作用引发，或由缺陷DNA引起的泄漏方面是有效的，但大都会导致催化反应动力学减慢，有时甚至损失反应产率。因此，我们探索能在保证催化反应动力学的基础上降低泄露反应速率的方式。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对传统CHA电路中通常产生难以忽视的背景信号的问题，通过分析CHA电路的内在泄漏途径，提供了一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法。
[0006]本专利技术是一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法，包括：
[0007](1)通过移除发夹1与发夹2的toehold片段，降低CHA反应的背景信号：
[0008]根据反应输入，利用NUPACK软件(https://www.nupack.org/partition/new)设计传统CHA反应体系所包含的两个发夹序列，并将发夹1与发夹2的toehold片段移除至不同长度；在TE Mg
2+
缓冲液中将发夹进行退火，具体的操作步骤为95℃处理5分钟，再缓慢将温度降至室温备用；于20μLTE Mg
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体系中加入两个发夹进行反应，反应温度为37℃，通过Rotor
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Gene Q实时荧光定量PCR分析仪(QIAGEN，德国)监测toehold移除前后的背景荧光变化。
[0009](2)通过将发夹中被移除的toehold移动至输入链，提升CHA催化速率：
[0010]对从发夹中移除的核酸片段进行长度与序列的适当优化，将其移动至传统输入序列中与打开发夹1无关的一端，形成新的输入链；在20μL TE Mg
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体系中加入两个发夹以及
输入链进行CHA反应，反应温度为37℃，通过Rotor
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Gene Q实时荧光定量PCR分析仪监测被移除片段移动前后的催化荧光变化，以及对不同浓度的两种输入的响应性变化。
[0011]本专利技术提供建立了一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法，解决泄露反应与目标反应的交织会导致严重的非特异性背景信号问题。其基本原理为将发夹中有引发泄漏嫌疑的toehold部分移除，降低泄漏反应速率，并将其移动至输入链中，只有当输入链被输入电路时，缺失的部分再次完整，以保证甚至提升催化反应速率，达到保证催化反应动力学的基础上降低泄露反应速率的效果，实验证明最大限度提高信噪比至100以上。本专利技术的设计及操作简便，有效提高CHA检测灵敏度、扩大CHA应用范围。
[0012]首先验证了部分移除发夹1的toehold(T1)或发夹2的toehold(T2)对泄漏反应的影响，以移除的T2为例，如图1所示，若发夹1靠近环的双链末端发生呼吸作用，意外暴露出之前被封闭在茎中的碱基，那么T2的自由碱基便会被吸引而向发夹1茎的部分不断入侵，图1中向左的箭头表示入侵力，由于T2已经被缩短，入侵力相对于普通长度的toehold长度被削弱；此外，在发夹1的茎中本身已存在大量已互补配对的碱基，会促进近环双链的再杂交，图1中向右的箭头表示碱基杂交力，此时碱基杂交力大于入侵力，且两者的差值应该是随着T2长度的减小而增大，使发夹1能拒绝发夹2的入侵，反向置换出发夹2，达到降低泄漏反应发生的效果。如图2所示，随着T2的不断降低，泄漏反应产生的荧光信号不断减少；同样地，随着T1的不断降低，泄漏反应产生的荧光信号不断减少(图3)。这证明了部分移除toehold对泄漏反应的成功抑制且移除T2效果更佳。
[0013]如图4所示，由于泄漏反应与催化反应共用一套发夹，如果将T2部分移除之后采用普通的输入链进行反应，降低泄漏反应的同时也会降低催化反应动力学。为了保证催化反应的速率，如图5所示，将从发夹中移除的核酸片段优化至8nt，再将其移动至传统输入中，形成新的输入链，让系统在发夹中损失的能量在引入输入链后得到补偿。从荧光动力学可以看出(图6)，催化反应速率h显著提升；此外，通过计算信噪比，证明了基于可移动toehold的低泄漏CHA具有优良的信噪比，其中将T2移动至4nt的效果最佳(图7)。
[0014]另外，还对低泄漏CHA的鲁棒性进行验证。在不同温度下(图8
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图9)、不同缓冲液中(图10
‑
图11)将toehold进行移动，均可以降低泄漏、提高信噪比。
[0015]最后，将传统CHA(图12)与低泄漏CHA(图13)对不同浓度输入的响应能力进行比较，可以看出我们提出的可移动toehold策略有效提高了灵敏度约50倍。
[0016]综上所述，我们证明了基于可移动toehold的低泄漏CHA反应具有高效性、简便性、鲁棒性，在保证催化反应动力学的基础上有效降低泄露反应速率，提高系统响应性能，从而扩展催化发夹自组装技术在实践中的应用范围。
附图说明
[0017]图1是通过缩短toehold抑制泄漏反应的原理示意图。
[0018]图2是不同长度T2的泄漏反应的荧光动力学曲线。
[0019]图3是不同长度T1的泄漏反应的荧光动力学曲线。
[0020]图4是部分移除T2后普通输入的反应效果图。
[0021]图5是可移动toehold设计原理图。
[0022]图6是基于可移动toehold设计的新输入的反应效果图。
[0023]图7是不同T1与T2的信噪比图。
[0024]图8是31℃下的反应效果图。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.本发明是一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法，包括：(1)通过移除发夹1与发夹2的toehold片段，降低CHA反应的背景信号：根据反应靶标，利用NUPACK软件(https://www.nupack.org/partition/new)设计传统CHA反应体系所包含的两个发夹序列，并将发夹1与发夹2的toehold片段移除至不同长度；在TE Mg
2+
缓冲液中将发夹进行退火，具体的操作步骤为95℃处理5分钟，再缓慢将温度降至室温备用；于20μLTE Mg
2+
体系中加入两个发夹进行反应，反应温度为37℃，通过Rotor
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Gene Q实时荧光定量PCR分析仪(QIAGEN，德国)监测toehold移除前后的背景荧光变化。(2)通过将发夹中被移除的toehold移动至输入链，提升CHA催化速率：优化从发夹中移除的核酸片段长度，将其移动至传统输入序列中与打开发夹1无关的一端，形成新的输入链；在20μL TE Mg
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体系中加入两个发夹以及输入链进行CHA反应，反应温度为37℃，通过Rotor
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Gene Q实时荧光定量PCR分析仪监测...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢国明，韩小乐，余红艳，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：