用于供体器官上的碳水化合物抗原切割的酶促组合物制造技术

本文提供了用于酶促切割来自供体器官的

【技术实现步骤摘要】
用于供体器官上的碳水化合物抗原切割的酶促组合物、与其相关的方法和用途
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求
2018
年8月
17
日提交的题为“用于碳水化合物抗原切割的酶促组合物，与其相关的方法
、
用途
、
设备和系统
(ENZYMATIC COMPOSITIONS FOR CARBOHYDRATE ANTIGEN CLEAVAGE,METHODS,USES,APPARATUSES AND SYSTEMS ASSOCIATED THEREWITH)”的美国临时专利申请系列第
62/719,272
号的权益
。


[0002]本专利技术涉及酶组合物领域
。
具体地，本专利技术涉及用于切割供体器官上的抗原的酶组合物，以及提供使用该组合物切割抗原的方法和用途
。
背景
[0003]血型的正确匹配是输血医学的主要要求，因为
A
血型个体的血浆含有针对
B
抗原的抗体，反之亦然，因此不相容的输血可以导致补体激活和红血细胞
(RBC)
裂解
(Daniels 2010)。
这些细胞表面抗原是分别终止于
A
型血和
B
型血的
α
‑
1,3
‑
连接的
‑
N
‑
乙酰基半乳糖胺
(GalNAc)
或半乳糖
(Gal)
的碳水化合物结构
。
另一方面，
O
型
RBC
不含有这些末端糖，并且可以被普遍输血
(Garratty 2008)。
因此，在患者血型未知或不清楚的紧急情况下，在血库中需要
O
型
RBC
的良好供应
。
然而，供应通常是有限的
。
[0004]Goldstein
首次提出并证明了从
A RBC
或
B RBC
酶促去除
GalNAc
或
Gal
结构作为将
A RBC
或
B RBC
转变成
O RBC
的手段的概念
(Goldstein 1982
；
US4609627
和
CA2272925)。
使用来自绿咖啡豆的
α
‑
半乳糖苷酶，将
B
型
RBC
转变为
O
型
RBC
，随后进行成功的输血
(Kruskall 2000)。
然而，所需的酶量使得该方法不切实际
。A
型的转变更具挑战性，主要是因为
A
型血液存在其内部连接不同的许多亚型
(Clausen 1989)。
类似地，已经使用
α
‑
半乳糖苷酶去除
B
型抗原
(
例如，参见
EP2243793)。
通过使用四糖底物筛选具有
A
和
B
转变活性的细菌文库，向包括
A
型在内的实际转变迈出了重要一步
。
发现两个新的糖苷酶家族在中性
pH
值下显示出高的抗原切割活性：
CAZy GH109
α
‑
N
‑
乙酰基半乳糖胺酶
(
α
‑
N
‑
acetylgalactosaminidases)
和
GH110
α
‑
半乳糖苷酶
(Liu 2007)。
两种酶都转变了它们相应的
RBC
，其中完全去除了各自的抗原
。
然而，转变仍然需要大量的酶，特别是
A
型
(60mg
酶
/
血液单位
)
，这限制了进一步的发展
。
在切割来自细胞的碳水化合物抗原方面具有更高效率的酶将是有用的
。
概述
[0005]本专利技术部分地基于出人意料的发现，即如本文所述的半乳糖胺酶
(Galactosaminidase)
和
GalNAc
脱乙酰酶的组合比先前鉴定的
A
抗原切割酶更有效几个数量级
。
例如，在一些条件下，一些
GalNAc
脱乙酰酶和半乳糖胺酶能够在1μ
/ml
或低于1μ
/ml
下切割
A
抗原
。
此外，将酶组合的切割效率维持在适于维持红细胞存活力的
pH(
即
pH
为约
6.5
至约
7.5)
下
。
另外，发现酶在
4℃
至
37℃
的温度下是有活性的，这也适用于血液收集
、
洗涤和存储方案
。
此外，通过添加拥挤剂
(
例如，右旋糖酐
)
进一步提高了酶的效率
。
还已经意识到，相同的两步切割过程可以被应用于供体器官
。
[0006]然而，本领域技术人员将理解，可以使用更多的酶来减少其中可以灌注供体器官的时间，或者可以使用更少的酶，只要供体器官的灌注时间更长
。
[0007]根据一个实施方案，用于酶促切割来自供体器官的
A
抗原的灌注流体，其包括：
(a)
纯化的
GalNAc
脱乙酰酶蛋白；和
(b)
纯化的半乳糖胺酶蛋白
。
[0008]根据另一个实施方案，提供了灌注流体，其中所述灌注流体包括：
(a)
所述
GalNAc
脱乙酰酶是选自以下中的一种或多种的纯化蛋白：
SEQ ID NO:2
；
SEQ ID NO:4
；
SEQ ID NO:5
；
SEQ ID NO:17
；
SEQ ID NO:23
；
SEQ ID NO:29
；
SEQ ID NO:31
；
SEQ ID NO:32
；
SEQ ID NO:33
；
SEQ ID NO:34
和
SEQ ID NO:35
；以及
(b)
所述半乳糖胺酶是选自以下中的一种或多种的纯化蛋白：
SEQ ID NO:7
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
用于酶促切割来自供体器官的
A
抗原的灌注流体，其包含
(a)
纯化的
GalNAc
脱乙酰酶蛋白；和
(b)
纯化的半乳糖胺酶蛋白
。2.
根据权利要求1所述的灌注流体，其中：
(a)
所述
GalNAc
脱乙酰酶是选自以下中的一种或多种的纯化蛋白：
SEQ ID NO:2
；
SEQ ID NO:4
；
SEQ ID NO:5
；
SEQ ID NO:17
；
SEQ ID NO:23
；
SEQ ID NO:29
；
SEQ ID NO:31
；
SEQ ID NO:32
；
SEQ ID NO:33
；
SEQ ID NO:34
和
SEQ ID NO:35
；以及
(b)
所述半乳糖胺酶是选自以下中的一种或多种的纯化蛋白：
SEQ ID NO:7
；
SEQ ID NO:9
；
SEQ ID NO:10
；
SEQ ID NO:19
；
SEQ ID NO:21
；
SEQ ID NO:36
和
SEQ ID NO:37。3.
根据权利要求1所述的灌注流体，其中所述灌注流体包含：具有
GalNAc
脱乙酰酶活性的纯化酶，其基本上由与
SEQ ID NO:2、4、5、17、23、29、31
和
32
‑
35
中之一所示序列至少
90
％相同的氨基酸序列组成；和具有半乳糖胺酶活性的纯化酶，其基本上由与
SEQ ID NO:7、9、10、19、21、36
和
37
中之一所示序列至少
90
％相同的氨基酸序列组成
。4.
根据权利要求1或2所述的灌注流体，其中所述灌注流体包含选自以下中的一种或多种的酶：
(a)
所述纯化的
GalNAc
脱乙酰酶蛋白是
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4
和
SEQ ID NO:5
的纯化的普氏梭杆菌
(Flavonifractor plautii)
的
GalNAc
脱乙酰酶蛋白；和
(b)
所述纯化的半乳糖胺酶蛋白是
SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9
和
SEQ ID NO:10
的纯化的普氏梭杆菌的半乳糖胺酶蛋白
。5.
根据权利要求1或2所述的灌注流体，其中所述灌注流体包含以下中的一种或多种：
(a)
所述纯化的
GalNAc
脱乙酰酶蛋白是
SEQ ID NO:17
或
SEQ ID NO:32
的纯化的第三梭状芽胞杆菌
(Clostridium tertium)
的
GalNAc
脱乙酰酶蛋白；和
(b)
所述纯化的半乳糖胺酶蛋白是
SEQ ID NO:19
或
SEQ ID NO:36
的纯化的第三梭状芽胞杆菌的半乳糖胺酶蛋白
。6.
根据权利要求1‑5中任一项所述的灌注流体，其中所述
GalNAc
脱乙酰酶和所述半乳糖胺酶能够在1μ
g/ml
或低于1μ
g/ml
下切割
A
抗原
。7.
根据权利要求1‑6中任一项所述的灌注流体，其中所述
GalNAc
脱乙酰酶和所述半乳糖胺酶在约
6.5
至约
7.5
的
pH
下具有
A
抗原切割活性
。8.
根据权利要求1‑7中任一项所述的灌注流体，其中所述
GalNAc
脱乙酰酶和所述半乳糖胺酶在
4℃
至
37℃
的温度下具有
A
抗原切割活性
。9.
根据权利要求1‑8中任一项所述的灌注流体，其中所述灌注流体还包含缓冲的细胞外溶液
。10.
根据权利要求9所述的灌注流体，其中所述缓冲的细胞外溶液选自：
Steen
TM
；
Perfadex
TM
；
Perfadex Plus
TM
；
EuroCollins
溶液；组氨酸
‑
色氨酸
‑
酮戊二酸
(HTK)
溶液；威斯康星大学溶液
(UW)
；
Celsior
溶液；肾脏灌注液
(KPS
‑
1)
；京都大学溶液；
IGL
‑1溶液；和柠檬酸盐溶液
。11.
用于离体酶促切割来自供体器官的
A
抗原的方法，所述方法包括：
(a)
用包含
GalNAc
脱乙酰酶蛋白和半乳糖胺酶蛋白的流体灌注展示
A
型抗原的供体器官一段时间，所述时间足以允许所述酶切割来自所述供体器官的
A
抗原；或者
(b)
使展示
A
型抗原的供体器官与包含
GalNAc
脱乙酰酶蛋白和半乳糖胺酶蛋白的流体一起孵育一段时...

【专利技术属性】
技术研发人员：马塞洛，
申请(专利权)人：大学健康网络，
类型：发明
国别省市：