一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒技术

本发明专利技术涉及物质检测技术领域，尤其涉及一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒。本发明专利技术维生素D代谢物的衍生方法，包括如下步骤：(1)沉淀生物样品中的蛋白，得到待处理的生物样品；(2)对所述的待处理的生物样品进行过膜处理，得到滤液；将所述的滤液与衍生试剂1反应2～10min，得到中间液；(3)在所述的中间液中加入衍生试剂2，反应2～10min，氮气吹干后，复溶得到维生素D代谢物；所述维生素D代谢物为25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3。本发明专利技术的方法可以定量检测维生素D代谢物，方法稳定高效，具有良好的临床意义。义。义。

【技术实现步骤摘要】
一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒


[0001]本专利技术涉及物质检测
，尤其涉及一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒。

技术介绍

[0002]维生素D是一类人体必须的脂溶性维生素，被认为是决定人体体质情况的重要指标，也是体内钙吸收的重要衡量标准，经过肝脏和肾脏代谢，会产生一系列代谢物。25
‑
羟基维生素D是血中被检测的标志物，是人体内维生素D的主要储存形式，通过检测它可以确定总体维生素D的情况，是衡量人体内维生素D营养状态的最佳指标。25
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羟基维生素D3(25(OH)D3)、D2(25(OH)D2)(结构式如图1、2)已有大量临床研究，与诸如儿童佝偻病，冠心病，糖尿病，小儿头疼，癌症等众多疾病有密切关系。1α,25(OH)2D3也是其中的一种活性代谢物。近来研究表明，1α,25(OH)2VD3可促进小肠对钙磷的吸收，维持钙、磷正常代谢及骨骼矿化，调节钙、磷在肾脏的重吸收。被用作为肾相关疾病的生物标志物，而且直接作用于骨代谢的骨骼细胞上。1α,25(OH)2VD3还影响二型糖尿病人血清中维生素D受体的表达。
[0003]分别检测25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3才能正确评估维生素D水平和维生素D补充疗法的疗效。因此，分别测定25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3可以直接反映生物体内维生素D真实活性的水平，具有重要的临床意义和疗效判定意义。
专利技术内容
[0004]本专利技术的目的在于提供一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种维生素D代谢物的衍生方法，包括如下步骤：
[0007](1)沉淀生物样品中的蛋白，得到待处理的生物样品；
[0008](2)对所述的待处理的生物样品进行过膜处理，得到滤液；将所述的滤液与衍生试剂1反应2～10min，得到中间液；
[0009](3)在所述的中间液中加入衍生试剂2，反应2～10min，氮气吹干后，复溶得到维生素D代谢物的衍生物；
[0010]所述维生素D代谢物为25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3。
[0011]作为优选，所述生物样品为血清；
[0012]步骤(1)所述沉淀生物样品中的蛋白的方法为：将生物样品与蛋白沉淀试剂混合，反应3～5min；
[0013]所述生物样品与蛋白沉淀试剂混合的体积比为1～20:60；
[0014]所述蛋白沉淀试剂为甲醇或乙腈。
[0015]作为优选，步骤(2)所述过膜处理为过有机滤膜；
[0016]所述膜的孔径为0.2～0.25μm。
[0017]作为优选，所述衍生试剂1为甲醇或乙腈；
[0018]所述甲醇为含有碘苯二乙酸的甲醇；
[0019]所述碘苯二乙酸的终浓度为1～10mg/mL；
[0020]所述滤液与衍生试剂1的体积比为2～4：1；
[0021]步骤(2)所述反应的温度为20～30℃。
[0022]作为优选，所述衍生试剂2为4
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[4
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(二甲基氨基)苯基]‑
1,2,4
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三唑烷
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3，5
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二酮溶液；
[0023]所述4
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[4
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(二甲基氨基)苯基]‑
1,2,4
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三唑烷
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3，5
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二酮溶液的溶剂为甲醇或乙腈；
[0024]所述4
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[4
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(二甲基氨基)苯基]‑
1,2,4
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三唑烷
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3，5
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二酮溶液的终浓度为1～10mg/mL；
[0025]步骤(3)所述反应的温度为20～30℃。
[0026]作为优选，所述复溶的溶剂为乙腈或甲醇。
[0027]本专利技术还提供了所述的衍生方法得到的维生素D代谢物的衍生物，所述维生素D代谢物的衍生物用于检测维生素D代谢物。
[0028]本专利技术还提供了一种检测维生素D代谢物的方法，包括如下步骤：
[0029]利用LC
‑
MS/MS方法检测权利要求7所述的维生素D代谢物的衍生物；
[0030]流动相A相为0.1～0.2vt％的甲酸水溶液；
[0031]流动相B相为甲酸甲醇溶液；
[0032]所述甲酸甲醇溶液的制备方法为：按甲酸与甲醇体积比为1～2:1000混合，得到；
[0033]色谱柱为C18色谱柱；
[0034]运行时间0min，流速0.4mL/min，流动相A 70％，流动相B 30％；
[0035]运行时间0.5min，流速0.4mL/min，流动相A 70％，流动相B 30％；
[0036]运行时间1min，流速0.4mL/min，流动相A 35％，流动相B 65％；
[0037]运行时间5min，流速0.4mL/min，流动相A 0％，流动相B 100％；
[0038]运行时间5.01min，流速0.4mL/min，流动相A 70％，流动相B 30％；
[0039]运行时间6.5min，流速0.4mL/min，流动相A 70％，流动相B 30％。
[0040]作为优选，质谱条件如下：
[0041]气帘气10psi、碰撞气8psi、离子化电压5500V、离子源温度500℃、雾化气GS118psi、辅助气GS250psi；
[0042]检测25(OH)D2时的母离子为631.3、子离子为341.2、停留时间50s，去簇电压200V、入口电压10V、碰撞电压31V、碰撞室电压11V；
[0043]检测25(OH)D3时的母离子为619.3、子离子为341.2、停留时间50s，去簇电压200V、入口电压10V、碰撞电压35V、碰撞室电压11V；
[0044]检测1α,25(OH)2VD3时的母离子为635.3、子离子为357.2、停留时间50s，去簇电压28V、入口电压13V、碰撞电压31V、碰撞室电压3V。
[0045]本专利技术还提供了一种检测维生素D代谢物的试剂盒，包括衍生试剂1和衍生试剂2；
[0046]所述衍生试剂1为甲醇或乙腈；
[0047]所述甲醇为含有碘苯二乙酸的甲醇；
[0048]所述衍生试剂2为4
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[4
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(二甲基氨基)苯基]‑
1,2,4
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三唑烷
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3，5
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二酮溶液；
[0049]所述4
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[4
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种维生素D代谢物的衍生方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)沉淀生物样品中的蛋白，得到待处理的生物样品；(2)对所述的待处理的生物样品进行过膜处理，得到滤液；将所述的滤液与衍生试剂1反应2～10min，得到中间液；(3)在所述的中间液中加入衍生试剂2，反应2～10min，氮气吹干后，复溶得到维生素D代谢物的衍生物；所述维生素D代谢物为25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3。2.根据权利要求1所述的衍生方法，其特征在于，所述生物样品为血清；步骤(1)所述沉淀生物样品中的蛋白的方法为：将生物样品与蛋白沉淀试剂混合，反应3～5min；所述生物样品与蛋白沉淀试剂混合的体积比为1～20:60；所述蛋白沉淀试剂为甲醇或乙腈。3.根据权利要求2所述的衍生方法，其特征在于，步骤(2)所述过膜处理为过有机滤膜；所述膜的孔径为0.2～0.25μm。4.根据权利要求3所述的衍生方法，其特征在于，所述衍生试剂1为甲醇或乙腈；所述甲醇为含有碘苯二乙酸的甲醇；所述碘苯二乙酸的终浓度为1～10mg/mL；所述滤液与衍生试剂1的体积比为2～4：1；步骤(2)所述反应的温度为20～30℃。5.根据权利要求4所述的衍生方法，其特征在于，所述衍生试剂2为4
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[4
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(二甲基氨基)苯基]
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1,2,4
‑
三唑烷
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3，5
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二酮溶液；所述4
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[4
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(二甲基氨基)苯基]
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1,2,4
‑
三唑烷
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3，5
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二酮溶液的溶剂为甲醇或乙腈；所述4
‑
[4
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(二甲基氨基)苯基]
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1,2,4
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三唑烷
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3，5
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二酮溶液的终浓度为1～10mg/mL；步骤(3)所述反应的温度为20～30℃。6.根据权利要求5所述的衍生方法，其特征在于，所述复溶的溶剂为乙腈或甲醇。7.权利要求1～6任意一项所述的衍生方法得到的维生素D代谢物的衍生物，其特征在于，所述维生素D代谢物的衍生物用于检测维生素D代谢物。8.一种检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，包括如下步骤：利用LC
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MS/MS方法检测权利要求7所述的维生素D代谢物的衍生物；流动相A相为0.1～0...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋征奇，张浩然，孙文泽，杨彩燕，曾永福，孟庆江，
申请(专利权)人：河北乾业生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：