一种基于逻辑门响应的化学发光法检测卵巢癌外泌体的生物传感器制造技术

本发明专利技术属于传感器技术领域，涉及一种基于逻辑门响应的化学发光法检测卵巢癌外泌体的生物传感器。基于卵巢癌外泌体蛋白对应适配体的特异性识别、滚环扩增反应以及G4/血红素DNA酶的催化性构建了化学发光生物传感器。该传感器具有检测范围广，检测限低，特异性高等优点，可以弥补卵巢癌早期诊断中现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。准确的定量检测。准确的定量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于逻辑门响应的化学发光法检测卵巢癌外泌体的生物传感器


[0001]本专利技术属于传感器
，涉及一种基于逻辑门响应的化学发光法检测卵巢癌外泌体的生物传感器。

技术介绍

[0002]卵巢癌（OC）是全球妇科癌症死亡的第二大常见原因，由于卵巢癌组织的亚型众多，及时诊断、适当的手术和系统的治疗具有挑战性。外泌体携带丰富的重要成分，包括蛋白质、DNA、RNA和其他生物活性物质。它们在各种疾病和病理生理过程中发挥重要作用，体液中癌症外泌体的数量与癌症的进展密切相关。因此，癌症外泌体已被视为无创和早期检测肿瘤癌变的潜在生物标志物。
[0003]目前，已经建立了各种检测癌症外泌体的方法，包括传统的纳米颗粒跟踪分析（NTA），酶联免疫吸附试验（ELISA），流式细胞术等。但由于操作步骤复杂，分析仪器昂贵，这些方法还面临着一些问题已经难以适应癌症外泌体检测的方便、快捷、灵敏度等方面的要求。目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测卵巢癌外泌体。

技术实现思路

[0004]为了实现更加灵敏、特异性的检测卵巢癌外泌体，本申请提出了一种卵巢癌外泌体蛋白与带有适配体的DNA三元复合物特异性结合从而暴露滚环扩增引物连接的单链，经phi29DNA酶切割该单链后暴露引物，进而引发滚环扩增反应得到大量G4，与溶液中氯化血红素结合形成可以催化化学发光的G4/血红素DNA酶，最终通过催化过氧化氢产生活性氧氧化鲁米诺检测卵巢癌外泌体的生物传感器。
[0005]本专利技术的技术方案如下：一种基于逻辑门响应的化学发光法检测卵巢癌外泌体的生物传感器，包括卵巢癌外泌体、C1、C2、CT、phi29DNA酶、dNTP、过氧化氢、鲁米诺、氯化血红素；C1由卵巢癌外泌体的特异性适配体CA24A
‑
5、触发滚环扩增的引物链primer、与Apt2互补的cSYL3C组成；C1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；具体为：5
’‑
TATGTGGGTGGGTGGGTGGTTATGCTGAGTCAGCCTTGCTTTTTTTTTGCTAGAAGGAAACAGTTACACCTCTGTAGTG
‑3’
；CT是由挂锁探针和连接序列得到的滚环扩增模板；CT中的挂锁探针的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；具体为：5
’‑
TAGCACGGACATTTTCCCAACCCGCCCTACCCTTTTTTTTTTCCCAACCCGCCCTACCCTTTTGTAACTGTTTCCTTC
‑3’
；CT中的连接序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；具体为：5
’‑
TGTCCGTGCTAGAAGGAAACAGTTAC
‑3’
；C2是适配体SYL3C，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；具体为：5
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CAC TAC AGA GGT TGC GTC TGT CCC ACG TTG TCA TGG GGG GTT GGC CTG
ꢀ‑3’
。
[0006]进一步地，卵巢癌外泌体与C1和C2特异性结合；cSYL3C经phi29DNA酶切割后暴露
引物primer，引发CT的滚环扩增得到G4，与氯化血红素结合形成G4/血红素DNA酶，催化过氧化氢氧化鲁米诺从而得到化学发光信号。
[0007]进一步地，所述的C2链3
’
端修饰有inVDT，其作用是可以防止链的反转。
[0008]进一步地，滚环扩增模板CT的制备方法，挂锁探针和连接探针在缓冲液中混合，加入T4DNA酶以及核酸外切酶Ⅰ和Ⅲ加热孵育后合成得到。
[0009]本专利技术的另一个目的，是保护上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）制备DNA三元复合物：将C1、CT和C2在缓冲液中混合，并加入phi29DNA酶加热孵育，即得；（2）DNA三元复合物与外泌体的孵育后滚环扩增，得到G4；（3）G4/血红素DNA酶的制备：由步骤（2）得到的G4，加入氯化血红素，加热孵育得到G4/血红素DNA酶；（4）化学发光反应：将步骤（3）得到的G4/血红素DNA酶与过氧化氢、鲁米诺混合，从而发生化学发光反应产生化学发光信号。
[0010]进一步地，步骤（1）的缓冲液包括0.05 mMNaCl、0.05 mM MgCl2以及100 mMTris
‑
HCl。
[0011]进一步地，步骤（1）中C1、CT和C2的加入量为等浓度加入。
[0012]进一步地，步骤（2）的过程为：将步骤（1）的DNA三元复合物和卵巢癌外泌体进行孵育识别，然后加入dNTP、phi29DNA酶以及10
×
phi29DNA缓冲液进行滚环扩增反应，得到G4。
[0013]本专利技术的另一目的，保护上述制备方法制备的生物传感器。
[0014]本专利技术的有益效果本专利技术的基于逻辑门响应的化学发光法检测卵巢癌外泌体的生物传感器，利用了卵巢癌外泌体蛋白对应的适配体进行特异性响应，从而经过phi29DNA酶对单链的切割暴露出G4扩增前的引物，进而引发CT进行滚环扩增反应得到大量G4，在与氯化血红素孵育后形成具有强催化效果的G4/血红素DNA酶，最终催化过氧化氢产生活性氧，氧化发光底物鲁米诺，实现化学发光信号的放大。该传感器利用化学发光的方法进行卵巢癌外泌体的双特异性检测，与其他荧光法、电化学法、表面拉曼等方法相比，该方法操作简单、假阳性信号弱、反应速度快，且在检测卵巢癌外泌体时检测迅速、定量准确、灵敏度高。
附图说明
[0015]图1是本专利技术实施例的传感器的示意图；图2是本专利技术实施例2中DNA体积优化图；图3是本专利技术实施例3中氯化血红素浓度优化图；图4是本专利技术实施例4中卵巢癌外泌体浓度梯度图。
具体实施方式
[0016]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0017]实施例1
滚环扩增模板CT的制备：将1.8 μL挂锁探针和5.4 μL连接序列混合85℃反应5 min后缓慢降至室温，向其加入12 μLT4DNA酶、5 μL10
×
T4缓冲液、10 μL 0.5 mg/mL BSA、15.8 μL DEPC水，在4 ℃条件下反应过夜后加热到65 ℃反应10 min，放入
‑
20 ℃冰箱保存。
[0018]DNA三元复合物的制备：取等浓度（10 μM）4 μLC1、8 μLC2、8 μLCT和17 μL 缓冲液（0.05 mMNaCl、0.05 mM MgCl2以及100 mMTris
‑
HCl）混合95 ℃加热5 min后缓慢冷却至室温，加入2 μLphi29DNA酶、4.7 μL10
×
phiDNA酶缓冲液后30 ℃反应60 min后再加热本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于逻辑门响应的化学发光法检测卵巢癌外泌体的生物传感器，其特征在于，包括卵巢癌外泌体、C1、C2、phi29DNA酶、dNTP、过氧化氢、鲁米诺、氯化血红素；C1由卵巢癌外泌体的特异性适配体CA24A
‑
5、触发滚环扩增的引物链primer、与Apt2互补的cSYL3C组成；C1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；具体为：5
’‑
TATGTGGGTGGGTGGGTGGTTATGCTGAGTCAGCCTTGCTTTTTTTTTGCTAGAAGGAAACAGTTACACCTCTGTAGTG
‑3’
；C2由挂锁探针和连接序列得到的滚环扩增模板CT以及具有阻断作用的卵巢癌另一个特异性适配体SYL3C组成；C2中的挂锁探针的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；具体为：5
’‑
TAGCACGGACATTTTCCCAACCCGCCCTACCCTTTTTTTTTTCCCAACCCGCCCTACCCTTTTGTAACTGTTTCCTTC
‑3’
；C2中的连接序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；具体为：5
’‑
TGTCCGTGCTAGAAGGAAACAGTTAC
‑3’
；适配体SYL3C的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；具体为：5
’‑ꢀ
CAC TAC AGA GGT TGC GTC TGT CCC ACG TTG TCA TGG GGG GTT GGC CTG
ꢀ‑3’
。2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，卵...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔维恒，赵岩，赵明珠，渠凤丽，颜昀天，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：