控制玉米蛋白含量和氮高效的关键基因制造技术

本发明专利技术公开了野生玉米天冬酰胺合成酶4基因Thp9在提高玉米籽粒蛋白含量、植株总氮含量和/或氮高效中的应用，通过提高天冬酰胺合成酶4的活性或者增强天冬酰胺合成酶4的表达，能够提高玉米的蛋白含量和对氮肥的利用率，对于高蛋白玉米新种质资源创制和农业生产及保护环境都具有重大经济意义。环境都具有重大经济意义。

【技术实现步骤摘要】
控制玉米蛋白含量和氮高效的关键基因


[0001]本专利技术属于农业基因工程领域，涉及野生玉米天冬酰胺合成酶4基因Thp9在提高玉米籽粒蛋白含量、植株总氮含量和/或氮高效中的应用。

技术介绍

[0002]玉米(Zea mays L.)的品质直接影响肉奶的产量和质量，是影响畜牧业发展水平的重要决定因素。同时，随着人民生活水平的提高，消费者对玉米品质的关注度越来越高，而蛋白营养品质(总蛋白总量)是广泛关注的重要指标。然而生产中普遍的玉米蛋白含量约在7％
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9％之间，作为饲料须通过额外添加豆粕等进行蛋白补充，大大提高了饲料成本，因此，提高玉米籽粒蛋白含量，在饲料中降低甚至零添加豆粕，是促进我国饲料工业和畜牧业的健康发展的重要途径。同时，作为青储玉米秸秆总氮的提高，游离氨基酸含量的提高，也将对畜牧业产生重大意义。因此，克隆控制玉米总蛋白含量的基因，解析高蛋白形成的机理，创制高蛋白含量新种质资源是保障粮食安全的重要策略。已报道在水稻上克隆到一个水稻的数量性状基因座(QTL)qPC1，编码的氨基酸转运蛋白OsAAP6与水稻蛋白含量相关，OsAAP6的高表达与高籽粒蛋白含量相关(Peng et al.,2014)。此外，通过测定400 多份水稻种质资源的总蛋白以及贮藏蛋白含量，并通过图位克隆与功能研究明确了 qGPC
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10(OsGluA2)负责编码稻米贮藏蛋白中的谷蛋白前体，能够显著影响稻米蛋白质含量并最终影响稻米的营养品质(Yang et al.,2019)。科学家通过近红外分析测定了 2009年和2010年961份群体材料，发现玉米籽粒蛋白含量存在7.32％
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15.20％的变异 (Karn et al.,2017)，然而至今还未克隆到控制其蛋白含量的基因位点。
[0003]玉米籽粒胚乳是营养物质的主要储存器官，其中淀粉和蛋白质是最主要的两种储藏物质。常见玉米自交系的总蛋白含量约为10％，淀粉约为70％(Flint
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Garcia et al.,2009)。蛋白质根据溶解性分为醇溶蛋白(zein)、清蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)和谷蛋白 (glutelin)(Wu and Messing,2017)。玉米作为饲料和粮食时，不同种类蛋白质的丰度和氨基酸构成差异极大，决定了玉米的营养品质。玉米主要储存蛋白是醇溶蛋白，即zein，占总蛋白60％以上。Zein根据氨基酸同源性分为α(19和22
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kD)、β(15
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kD)、γ(50，27和16
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kD) 和δ(18和10
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kD)四个亚家族。α
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zein丰度最高，占总zein含量50％以上(Esen,1987；Thompsonand Larkins,1994)。然而，几乎所有的zein都不含必需氨基酸赖氨酸和色氨酸，这导致玉米胚乳总蛋白极度缺乏这两种氨基酸(Mertz et al.,1964)。Opaque2(O2)是玉米胚乳重要转录因子，在O2突变体中，醇溶蛋白zein表达下降60％以上，然而由于蛋白质的平衡机制使非醇溶蛋白表达补偿性地上调，最终总蛋白含量只有略微下降。非醇溶蛋白中赖氨酸含量丰富，因此O2突变体中赖氨酸含量是普通玉米的两倍左右；用O2玉米饲养的小白鼠明显比对照(用普通玉米)生长快(Mertz et al.,1965)。然而O2是粉质胚乳，籽粒易破碎，且易发霉感病，总蛋白含量偏低(约8
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9％)，产量低，因此不能直接进行产业化和种植利用。创制新型优质高蛋白玉米在粮食生产和安全性上都将产生重大意义。
[0004]已报道在水稻氮素高效利用研究中克隆出几个影响水稻氮高效的基因，硝酸盐转
运蛋白基因NRT1.1B的自然变异是介导籼稻和粳稻氮素利用效率不同的关键因子，籼稻型 NRT1.1B等位基因具有氮高效的特性(Hu et al.,2015)。此外，利用全基因组关联分析 (genome
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wide association study，GWAS)，发现水稻TCP转录因子家族成员基因OsTCP19 是控制水稻适应不同土壤氮素高低环境的关键因子(Liu et al.,2021)。同时，研究揭示GA 信号通路协同调控水稻生长与氮代谢，水稻转录因子GROWTH
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REGULATING FACTOR 4 (GRF4)(Li et al.,2018)和APETALA2结构域的转录因子NITROGEN
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MEDIATED TILLERGROWTH RESPONSE 5(NGR5)是介导氮素调控分蘖形成的关键因子(Wu et al.,2020)。这些基因的优异等位变异实现了低氮生长条件下的增产、稳产，为水稻氮素高效利用提供了重要资源。然而，如何提高氮肥的利用率或者提高玉米植株的氮素高效感知吸收同化转运，挖掘玉米氮高效基因的挖掘和分子模块是现阶段农业生产上亟待解决的重大科学难题。

技术实现思路

[0005]提高玉米蛋白含量需要具有高蛋白含量的材料作为供体，我们对30余份不同野生玉米进行蛋白含量测定和分析，发现野生玉米蛋白含量约为30％，因此，野生玉米是创制高蛋白玉米新种质优良的基因供体资源，将野生玉米作为供体导入到栽培玉米是一种提高玉米蛋白含量的方法。为了深入解析野生玉米中控制蛋白含量的主效QTL基因位点，从2012 年起，我们选用野生玉米大刍草(Zea mays ssp.Parviglumis,Ames21814，下文中用 Ames21814或者Teosinte(Teo)表示)作为我们构建群体的导入供体。野生玉米Ames21814 蛋白含量达到30％，并且α
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zein和富含营养赖氨酸含量的non
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zein部分均显著增加，是提高玉米蛋白含量的天然供体代表之一。历经10年的努力，大量遗传群体的分析，连续10 代近等基因系群体的创建，上万份蛋白含量的测定，我们克隆到玉米首个控制总蛋白含量的主效QTL基因位点，并通过三代测序，解析组装了高质量的野生玉米Ames21814基因组序列。本专利技术挖掘野生玉米中控制高蛋白玉米形成关键基因Thp9，该基因不仅可以显著增加玉米蛋白含量和生物量，同时可以增加玉米的氮素利用效率，减少氮肥使用量。此外，我们还开发出该基因的分子标记，将野生玉米高蛋白基因Thp9导入栽培玉米，培育创制出高蛋白玉米新种质资源。据此，本专利技术包括如下所述的技术方案。
[0006]本专利技术的第一个方面在于提供野生玉米天冬酰胺合成酶4基因比如Thp9在提高玉米籽粒蛋白含量、植株总氮含量和/或氮高效中的应用。
[0007]具体地讲，所述野生玉米天冬酰胺合成酶4基因比如Thp9应用可以选自下组方式：将野生玉米天冬酰胺合成酶4编码基因比如Thp9导入普通玉米染色体中；使玉米过表达野生玉米天冬酰胺合成酶4基因比如Thp9；使玉米过表达普通玉米原有天冬酰胺合成酶4 基因ZmASN4；将控制野生玉米天冬本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.野生玉米天冬酰胺合成酶4基因在提高玉米籽粒蛋白含量、植株总氮含量和/或氮高效中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用选自下组方式：将野生玉米天冬酰胺合成酶4编码基因导入普通玉米染色体中；使玉米过表达野生玉米天冬酰胺合成酶4基因；使玉米过表达普通玉米原有天冬酰胺合成酶4基因ZmASN4；将控制野生玉米天冬酰胺合成酶4基因表达量的调控区域导入玉米使该基因表达量提高。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述普通玉米原有天冬酰胺合成酶4基因ZmASN4对于自交系玉米B73而言是指Zm00001d047736。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述野生玉米天冬酰胺合成酶4基因的核苷酸序列选自下组：(A)如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸，命名为Thp9，基因编号为Teo09G002926，NCBIGenome submission:SUB11272093；(B)与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的同源性≥80％、≥85％、≥90％、优选≥95％、更优选≥98％的多核苷酸。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述野生玉米天冬酰胺合成酶4是选自下组的多肽：(a)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；(c)与(a)限定的多肽序列有95％以上同源性，优选地98％以上同源性，更优地99％以上同源性，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述多肽序列的衍生多肽。6.如权利要求2或4所述的应用，其特征在于，将野生玉米天冬酰胺合成酶4编码基因导入玉米染色体中的方法包括如下步骤：(1)将所述野生玉米天冬酰胺合成酶4编码基因克隆到适合于在农杆菌中表达的植物表达载体中，得到该基因的表达载体；(2)载体经过测序验证后，将该基因的表达载体用农杆菌介导法转化玉米幼胚，获得过表达该基因的转基因玉米。7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述pCAMBIA载体是以玉米Ubiquitin启动子驱动的pCAMBIA3300载体。8.一种用于实施如权利要求4所述应用的试剂盒，其包含：SEQ ID NO:1的Thp9基因片段或者其CDS序列SEQ ID NO:3、用于将该基因片段或者其CDS序列克隆入植物表达载体所需的PCR引物；或者包含：如权利要求5或6中所述的基因表达载体，用于将基因表达载体转入农杆菌中的试剂；或者包含：转入了如权利要求5或6中所述的基因表达载体的农杆菌，用于将农杆菌转化植株的试剂。9.一种检测玉米基因组中如权利要求3或4所述的基因的方法，包括下述步骤：检测核苷酸序列为SEQ ID NO:1的Thp9基因时，正向引物thp9
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F：
CTCTGTGCCATGCATCCTCC，反向引物thp9
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R：CGTCAGCGCTGGTTAGC，PCR产物为198bp的SEQ ID NO:4，其为Thp9高蛋白位点的分子标记：CTCTGTGCCATGCATCCTCCGCAGCATATTCTGTACAGGCAGAAAGAACAGTTCAGTGACGGAGTGGGCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：巫永睿，黄永财，王海海，路小铎，
申请(专利权)人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：