阿胶特征肽、制备方法、组合物及其在制备孕前调理膏方上的应用技术

本发明专利技术涉及阿胶技术领域，具体涉及阿胶特征肽、制备方法、组合物及其在制备孕前调理膏方上的应用。本发明专利技术以阿胶粉为原料，采用环己烷、二氯甲烷进行萃取，萃取后溶液进行胃蛋白酶和胰酶酶解，对酶解后溶液进行超滤和凝胶色谱纯，得到该阿胶特征肽。该阿胶特征肽具有抗氧化能力、铁螯合能力，肠黏膜透过能力，更容易被肠黏膜细胞吸收，进而增强机体对铁的吸收利用率，能够调节模型大鼠KNDy神经元相关基因的表达，提升模型小鼠血清E2、P含量，起到对LPD模型大鼠的内分泌起到调控作用。给予本发明专利技术提供的阿胶特征肽，具有孕前的滋补作用，能够用作制备孕前调理膏方的原料，具有广泛的应用前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
阿胶特征肽、制备方法、组合物及其在制备孕前调理膏方上的应用


[0001]本专利技术涉及阿胶
，具体涉及阿胶特征肽、制备方法、组合物及其在制备孕前调理膏方上的应用。

技术介绍

[0002]阿胶含明胶、蛋白质、微量元素等多种有效成分，具有抗疲劳、抗氧化、增强免疫、促进造血功能等多种功效。通常认为在阿胶中起主要功效的化学成分是多肽和蛋白质的混合物。阿胶蛋白需要经蛋白酶降解为小分子肽后才能被吸收，但对于脾胃虚弱、消化能力低下的人群，直接服用阿胶或其制剂不但给胃肠带来较大负担，而且阿胶的功效也得不到充分发挥。因此，通过可控酶解技术将阿胶水解成小分子肽，能够有效增强阿胶的生物利用度。
[0003]研究表明，阿胶经酶解产生的生物活性肽，可提升阿胶的药理作用。刘元涛等研究证实，阿胶经酶解后，增强了提高小鼠免疫力的作用。Wu等研究发现，模拟人体消化过程酶解阿胶得到组分A(＜5000Da)和组分B(5000～8000Da)，2种组分均可刺激贫血小鼠造血，且组分A效果优于组分B。虽然关于小分子阿胶提高免疫力、抗氧化、抗疲劳、止血、补血的作用已有报道。然而，长期以来受到技术条件和传统思想的限制，阿胶的很多功效还未得到足够的现代科学理论和实验的证实。

技术实现思路

[0004]对于孕前女性，由于其排卵期紊乱等因素，可能出现黄体发育不良、分泌孕酮（P）、雌二醇（E2）等物质不足或黄体过早退化，使得子宫内膜分泌反应性降低，造成子宫出现异常、不孕和早期流产等严重症状，以此统称为黄体功能不全（LPD）。本专利技术提供了5种阿胶特征肽，通过试验证实其能够缓解LPD症状，表明这些阿胶特征肽不仅具有补血和转运铁功能，还能作为孕前调理膏方的原料，应用前景广泛。
[0005]本专利技术的目的之一提供一种阿胶特征肽的制备方法，包括：获得阿胶溶液；离心取上清液，用环己烷和二氯甲烷依次萃取，分别去除环己烷层和二氯甲烷层，得萃取后溶液；将所述萃取后溶液经离心、超滤、离心、浓缩和冻干，即得阿胶粗粉；将所述阿胶粗粉用胃蛋白酶酶解，收集第一酶解液。
[0006]将所述第一酶解液用胰酶酶解，收集第二酶解液。
[0007]将所述第二酶解液经离心、超滤、离心、浓缩和冻干，得到阿胶肽粗粉；将所述阿胶肽粉经凝胶色谱纯化，收集洗脱峰，即可得到所述阿胶特征肽。
[0008]在所述的制备方法中，获得阿胶溶液的步骤包括：将市售的阿胶粉混入用40倍量（40mL:1g）的含1%碳酸氢铵溶液，超声30min后，80
℃水浴30min，得到所述阿胶溶液。
[0009]在所述的制备方法中，所述环己烷的用量为所述上清液的1.5倍体积，所述二氯甲烷的用量为去除环己烷层后溶液的2倍体积。
[0010]在所述的制备方法中，将所述阿胶粗粉用胃蛋白酶酶解的步骤包括：将阿胶粗粉用1%的磷酸溶液配制成pH=2的样品液，加入10万U胃蛋白酶/g阿胶粗粉，42℃水浴2h后，100℃灭酶15min，收集，第一酶解液。
[0011]在所述的制备方法中，将所述第一酶解液用胰酶酶解的步骤包括：将所述第一酶解液用2%的碳酸氢钠调节pH=8，加入2万U胰酶/g阿胶粗粉，42℃水浴3h后，100℃灭酶15min，收集第二酶解液。
[0012]在所述的制备方法中，所述第二酶解液经离心后，采用3kDa超滤管进行超滤。
[0013]在所述的制备方法中，所述凝胶色谱纯化的条件包括：采用Sephadex G
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15作为填料，以去离子水作为洗脱液，上样量5 mL，流速1.0 mL/min，紫外检测仪波长为220 nm。
[0014]本专利技术的目的之二提供一种采用所述的制备方法制得的阿胶特征肽，所述阿胶特征肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4任一所示。
[0015]本专利技术的目的之三提供采用所述的制备方法制得的阿胶特征肽在制备孕前调理膏方中的应用。
[0016]本专利技术的目的之四提供一种阿胶特征肽组合物，包括如SEQ ID NO.2所示的肽、如SEQ ID NO.3所示的肽和如SEQ ID NO.4所示的肽。
[0017]与现有技术相比，本专利技术至少具有以下有益效果之一：本专利技术以市售阿胶粉为原料，采用环己烷、二氯甲烷进行萃取，萃取后溶液进行胃蛋白酶和胰酶酶解，对酶解后溶液进行超滤和凝胶色谱纯，得到该阿胶特征肽。经体外实验证实这是阿胶特征肽具有抗氧化能力，而仅P1~P5具有较好的铁螯合能力。另外，经外 Ussing chamber 吸收实验发现，P2~P4的铁累积转运量高于对照组，表现出了较高的肠黏膜透过能力，更容易被肠黏膜细胞吸收，进而增强机体对铁的吸收利用率，提示本专利技术提供的阿胶特征肽具有补血功效。
[0018]本专利技术实验例进一步构建LPD模型鼠，采用本专利技术制得的阿胶特征肽进行干预，结果发现这些阿胶特征肽能够调节模型大鼠KNDy神经元相关基因的表达，提升模型小鼠血清E2、P含量，起到对LPD模型大鼠的内分泌起到调控作用。由此可见，给予本专利技术提供的阿胶特征肽，具有孕前的滋补作用，能够应用于制备孕前调理膏方，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0019]图1为阿胶特征肽P1、阿胶特征肽P2、阿胶特征肽P3、阿胶特征肽P4、阿胶特征肽P5的Sephadex G
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15层析图谱。
[0020]图2为阿胶特征肽P6、阿胶特征肽P7、阿胶特征肽P8的Sephadex G
‑
15层析图谱。
[0021]图3为阿胶特征肽P2的二级MS图。
[0022]图4为阿胶特征肽P3的二级MS图。
[0023]图5为阿胶特征肽P4的二级MS图。
[0024]图6为阿胶特征肽P1、阿胶特征肽P2、阿胶特征肽P3、阿胶特征肽P4、阿胶特征肽P5、阿胶特征肽P6、阿胶特征肽P7和阿胶特征肽P8的IC50
‑
DPPH结果图，IC50
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DPPH代表对
DPPH清除率为50%的各阿胶特征肽浓度。
[0025]图7为阿胶特征肽P1、阿胶特征肽P2、阿胶特征肽P3、阿胶特征肽P4、阿胶特征肽P5、阿胶特征肽P6、阿胶特征肽P7和阿胶特征肽P8的IC50
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ABTS结果图，IC50
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ABTS代表对ABTS清除率为50%的各阿胶特征肽浓度。
[0026]图8为阿胶特征肽P1、阿胶特征肽P2、阿胶特征肽P3、阿胶特征肽P4和阿胶特征肽P5的铁累积转运量结果图，Qn代表铁累积转运量。
[0027]图9为阿胶特征肽P1、阿胶特征肽P2、阿胶特征肽P3、阿胶特征肽P4和阿胶特征肽P5的铁转运Papp结果图，Papp表征铁离子透过组织黏膜转运速率。
[0028]图10为阿胶特征肽作用LPD模型大鼠血清中E2含量结果图，E2为雌二醇，LPD模型大鼠为黄体功能不全（luteal phase defect，LPD）的大鼠。
[0029]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种阿胶特征肽的制备方法，其特征在于，包括：获得阿胶溶液；离心取上清液，用环己烷和二氯甲烷依次萃取，分别去除环己烷层和二氯甲烷层，得萃取后溶液；将所述萃取后溶液经离心、超滤、离心、浓缩和冻干，即得阿胶粗粉；将所述阿胶粗粉用胃蛋白酶酶解，收集第一酶解液；将所述第一酶解液用胰酶酶解，收集第二酶解液；将所述第二酶解液经离心、超滤、离心、浓缩和冻干，得到阿胶肽粗粉；将所述阿胶肽粉经凝胶色谱纯化，收集洗脱峰，即可得到所述阿胶特征肽。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，获得阿胶溶液的步骤包括：将市售的阿胶粉混入用40倍量（40mL:1g）的含1%碳酸氢铵溶液，超声30min后，80℃水浴30min，得到所述阿胶溶液。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述环己烷的用量为所述上清液的1.5倍体积，所述二氯甲烷的用量为去除环己烷层后溶液的2倍体积。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述阿胶粗粉用胃蛋白酶酶解的步骤包括：将阿胶粗粉用1%的磷酸溶液配制成pH=2的样品液，加入10万U的胃蛋白酶/g阿胶粗粉，42℃水浴2h后，100℃灭酶15min，...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾繁凯，
申请(专利权)人：山东中膏生命科学集团有限公司，
类型：发明
国别省市：