本发明专利技术公开了一种利用3D打印制备人工血管实现人脑类器官血管化的方法，包括如下步骤：将hPSCs贴壁培养，在神经诱导培养液中悬浮开始培养分化，分化第7天时用基质胶包埋后悬浮培养，利用3D打印设计软件设计出人工血管，并使用生物打印机打印，获得人工血管；将人工血管浸泡孵育，分化第30天时，将单个人脑类器官转移到单独的培养皿中，使人工血管穿过人脑类器官的中心区域，再转移到其他培养皿中进行培养，培养人工血管化的人脑类器官分化60天后，有明显差异，能够显著改善人脑类器官长期培养过程中氧气、营养物质供应，增大人脑类器官体积。官体积。官体积。
【技术实现步骤摘要】
一种利用3D打印制备人工血管实现人脑类器官血管化的方法
[0001]本专利技术属于生物医学工程和生物
，具体涉及一种3D打印微区梯度结构高熵合金/钛及钛合金复合材料及其制备方法和应用。
技术介绍
[0002]大脑结构和功能上的复杂性，尤其是人类独特的脑功能分区对脑科学研究提出了挑战。随着诱导多能干细胞重编程技术的问世，研究者们可以获得直接来自于患者且携带致病基因的iPSC，在一定条件下可以分化成任何类型的携带该基因的体细胞。尽管传统的2D培养体系所分化得到的细胞已形成成熟的商业和研究模式，用于科学研究、药物筛选和精准医疗，但这些细胞始终难以模拟人类大脑3D空间里客观真实的内环境，也无法反映出3D层面细胞间的相互作用，而这些3D特征是在脑发育和神经科学研究领域里相当重要的一部分。近年来，从hPSCs分化出来的人脑类器官被认为是研究人脑发育以及发病机制的有效实验模型。然而，大脑的发育成熟特别是晚期阶段高度依赖于脑室下区的血管化，没有血管的形成限制了类器官的氧气和营养物质的供应，往往造成中心区域的坏死，干扰神经元的迁移。因此，实现人脑类器官的血管化成为领域内亟待解决的重大课题。
[0003]目前人脑类器官的血管化方法还不成熟，主要通过将血管内皮细胞与人脑类器官共培养或者将人脑类器官移植到鼠脑中。然而，第一种方法引入血管内皮细胞与人脑类器官的相互作用，但仍然无法形成成熟的血管网络，无法解释清楚血管结构能否促进了氧气和营养供应，第二种方法血管化类器官具有成熟的血管网络，但需要异种移植，引入了不同种属的非同源细胞。而目前利用生物工程方法促进类器官培养的方法主要集中在整体培养上，如利用微型生物反应器改善整批次类器官的营养供应，而针对单个人脑类器官的生物工程方法主要是利用生物材料本身的性质，如利用蜘蛛丝纤维促进中脑类器官多巴胺神经元的分化。目前还没有明确提出利用生物材料构建血管化的营养运输通道的方法促进人脑类器官的氧气、营养物质供应。但是，现有技术中的培养没建立营养通道，只是名义上血管化。目前尚未有利用3D打印技术将商用化材料制备人工血管实现脑类器官血管化的研究。
[0004]因此，建立一种利用3D打印制备人工血管实现人脑类器官血管化的方法尤为重要。
技术实现思路
[0005]专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的是提供一种利用3D打印制备人工血管实现人脑类器官血管化的方法，能够显著改善人脑类器官长期培养过程中氧气、营养物质供应，增大人脑类器官体积。
[0006]本专利技术还提供所述的利用3D打印制备人工血管实现人脑类器官血管化的方法所制备的人工血管以及血管化的人脑类器官。
[0007]技术方案：为实现上述专利技术目的，本专利技术所述一种利用3D打印制备人工血管实现人脑类器官血管化的方法，其特征在于：包括如下步骤：
[0008]步骤1：将hPSCs贴壁培养，进行增殖后消化制成拟胚体，开始培养分化，此天记为第0天；
[0009]步骤2：分化第1天记为第1天，每天半换液进行培养；
[0010]步骤3：分化第7
‑
10天时用基质胶包埋后悬浮培养，每天半换液进行人脑类器官培养；
[0011]步骤4：利用3D打印设计软件设计出人工血管，并使用生物打印机打印，获得人工血管；
[0012]步骤5：在步骤3中培养分化第30
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35天时得到人脑类器官，将步骤4得到的人工血管在细胞培养液中中浸泡孵育后插入步骤(3)分化得到的单个人脑类器官中，使人工血管穿过人脑类器官的中心区域，再将人工血管化的人脑类器官转移到其他培养皿中；
[0013]步骤6：培养人工血管化的人脑类器官分化60天后，得到血管化的人脑类器官。
[0014]其中，步骤1中所述贴壁培养于在4℃的用基质胶Vitronectin提前一晚包被过的培养皿中，hPSCs在培养皿中增殖至60～80％密度时进行消化，孵育1～7分钟，显微镜下观察到克隆边缘发亮，并微微卷起时，将Dispase吸除，用DMEM/F12轻洗细胞，再用DMEM/F12轻轻将克隆吹下，一边吹一边将已吹下的克隆从液体中吸出转移至离心管中，离心后吸弃上清，将管底的细胞转移至细胞培养瓶中悬浮培养，换上培养液，将细胞制成EB，此时为细胞分化的第0天。
[0015]作为优选，步骤1中贴壁培养于在4℃的用基质胶Vitronectin提前一晚包被过的培养皿中，hPSCs在培养皿中增殖至60～80％密度时进行消化，置于37℃，5％ CO2的孵箱中孵育1～7分钟，显微镜下观察到克隆边缘发亮，并微微卷起时，将Dispase吸除，用DMEM/F12轻洗一遍细胞，再用DMEM/F12轻轻将克隆吹下，一边吹一边将已吹下的克隆从液体中吸出转移至15ml离心管中，将离心管离心，800rpm，1min后吸弃上清，将管底的细胞转移至细胞培养瓶中悬浮培养，换上神经诱导培养液(Neural induction medium，NIM)，将细胞制成EB，此时为细胞分化的第0天。
[0016]其中，所述提前一晚包被过的培养皿中培养液为Essential 8，由Essential 8
TM Basal Medium DMEM/F12(Ham)与Essential 8
TM Supplement配制而成；用Dispase进行消化。
[0017]作为优选，所述提前一晚包被过的培养皿中培养液为Essential 8，由体积比为50:1的Essential 8
TM Basal Medium DMEM/F12(Ham)(1:1)与Essential 8
TM Supplement(50X)配制而成；用1U/ml的Dispase进行消化，所述神经诱导培养液NIM为DMEM/F12培养基，NEAA，N2以体积比98:1:1配制而成。
[0018]其中，步骤3中所述的基质胶为Matrigel，按1X原液包埋。
[0019]其中，步骤1至步骤6中分化培养的培养液均为神经诱导培养液。
[0020]其中，步骤4所述中人工血管制备的具体步骤为：通过设计软件设计长为2～3mm，直径为200μm的空心圆柱体，并在侧壁设计出直径为20μm的圆形小孔，将设计信息保存为.stl格式，将.stl格式的设计信息导入软件中切片，在3D生物打印机中用光刻胶将设计双光子聚合打印成形，在显影液中浸泡过夜，洗去多余的光刻胶，再在异丙醇中浸泡过夜洗去显影液，从而获得人工血管。
[0021]其中，所述设计软件为Nanoscribe的DeScribe，所述3D生物打印机为Nanoscribe，
所述显影液为Nanoscribe显影液。
[0022]其中，步骤4中3D打印设计软件为3Ds MAX或AutoCAD，光刻胶为Nanoscribe公司产品IP
‑
S。
[0023]作为优选，通过3dMAX进行设计，导入Nanoscribe打印机中。
[0024]其中，步骤5中使用含Fibronect本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种利用3D打印制备人工血管实现人脑类器官血管化的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：将hPSCs贴壁培养，进行增殖后消化制成拟胚体，开始培养分化，此天记为第0天；步骤2：分化第1天记为第1天，每天半换液进行培养；步骤3：分化第7
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10天时用基质胶包埋后悬浮培养，每天半换液进行人脑类器官培养；步骤4：利用3D打印设计软件设计出人工血管，并使用生物打印机打印，获得人工血管；步骤5：在步骤3中培养分化第30
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35天时得到人脑类器官，将步骤4得到的人工血管在细胞培养液中浸泡孵育后插入步骤(3)分化得到的单个人脑类器官中，使人工血管穿过人脑类器官的中心区域，再将人工血管化的人脑类器官转移到其他培养皿中；步骤6：培养人工血管化的人脑类器官分化60天后，得到血管化的人脑类器官。2.根据权利要求1所述的利用3D打印制备人工血管实现人脑类器官血管化的方法，其特征在于：步骤1中所述贴壁培养于在4℃的用基质胶Vitronectin提前一晚包被过的培养皿中，hPSCs在培养皿中增殖至60～80％密度时进行消化，孵育1～7分钟，显微镜下观察到克隆边缘发亮，并微微卷起时，将Dispase吸除，用DMEM/F12轻洗细胞，再用DMEM/F12轻轻将克隆吹下，一边吹一边将已吹下的克隆从液体中吸出转移至离心管中，离心后吸弃上清，将管底的细胞转移至细胞培养瓶中悬浮培养，换上培养液，将细胞制成EB，此时为细胞分化的第0天。3.根据权利要求2所述的利用3D打印制备人工血管实现人脑类器官血管化的方法，其特征在于：所述提前一晚包被过的培养皿中培养液优选为Essential8，由Essential 8
TM Basal Medium DMEM/F12(Ham)与Essential 8
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【专利技术属性】
技术研发人员：顾忠泽，许磊，刘妍，丁海波，伍姗姗，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：
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