RNAi抑制CTGF用于治疗眼科疾病制造技术

提供了ＲＮＡ干扰技术用于抑制与ＣＴＧＦ表达有关的眼科疾病中结缔组织生长因子ｍＲＮＡ的表达。与异常ＣＴＧＦ表达有关的眼科疾病包括青光眼、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新血管形成、增殖性玻璃体视网膜病变和创伤愈合。通过施用本发明专利技术的干扰ＲＮＡ来治疗这些疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】RNAi抑制CTGF用于治疗目f^疾病专利
本专利技术涉及可抑制眼科疾病中结締组织生长因子(CTGF)表达的干扰 性RNA组合物领域。专利技术背景大多数眼科疾病都与细胞过程有关，这些过程包括细胞增殖、存活、 迁移、分化和血管发生。CTGF是这些细胞过程的一种分泌的细胞因子和 主J^h体。具体地，已知CTGF主要通过增加胶原蛋白I和纤连蛋白的沉 积来增加细胞外基质的产生。CTGF的it^达被认为是硬皮病、纤维增生 疾病、痣痕形成等疾病的主要病因因素，这些疾病中存在细胞外基质成分 的过度积累.在小梁网(TM)区域的细胞外基质物质的过度积累是很多类型青光眼 的标志，这种增加被认为增加了对水性流出物的阻力，从而导致眼内压升 高。于2003年11月13日以WO 03/092584公布并转让给Alcon公司的 Fleenor等人的国际专利申请号PCT/US2003/012521描述在青光眼TM细 胞中CTGF mRNA较正常TM细胞中有所增加。因此，可以认为CTGF 在小梁网细胞的细胞外基质产生中发挥作用。黄斑变性是负责高精度视觉的中夹视网膜部分(被称作黄斑区)中感光 细胞的丧失。黄斑变性与视网膜色素上皮和血管脉络膜之间膜中细胞外基 质成分的异常沉积有关。这种碎屑状物质被称作脉络膜小疣。眼底镜检查 可以观察到脉络膜小疣。正常眼睛的黄斑区没有脉络膜小疣，而在视网膜 周围可能富含脉络膜小疣。如杲黄斑视力没有任何损失而在黄斑区出现软 的脉络膜小疣，可以认为是AMD的早期。除了其他一些眼科疾病，脉络膜新血管形成还经常发生在黄斑变性中， 并且与脉络膜内皮细胞增殖，细胞外基质的过量产生和纤维血管性视网膜 下膜的形成有关。视网膜色素上皮细胞的增殖和血管生成因子的产生似乎 实现脉络膜新血管的形成。糖尿病性视网膜病变是一种糖尿病中发生在由毛细血管基底膜增厚和 毛细血管周细胞和内皮细胞之间缺乏接触引起的的眼科疾病。周细胞的丧 失增加了毛细血管的渗漏，导致血-视网膜屏障的破坏。化膜的细胞增殖有关。视网膜色素上皮细胞的增殖和迁移在这种眼科疾病 中很常见。与增殖性玻璃体视网膜病变有关的膜包括细胞外基质成分如I型、n型和iv型胶原蛋白，纤粘蛋白，而且这些膜会变得逐渐纤维化。创伤愈合疾病可以通过激活炎症细胞、释放生长因子和细胞因子、眼 细胞的增殖和分化、毛细血管通透性的增加、基Ji膜基质成分的改变、细 胞外JJt的沉积增加、纤维化、新血管形成和组织重塑，导致严重的目fUa 织损伤。因此，CTGF的it^达被认为是这些目醋疾病的主要病因因素。目前的治疗手段没有直^i"对这些疾病的发病机制。 专利技术概述本专利技术涉及能够耙向CTGF mRNA并干扰CTGF mRNA表达的千扰 RNA。专利技术的这种干扰RNA可用于治疗CTGF相关的目科疾病如青光眼、 黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新血管形成、增殖性玻璃体视网 膜病变和异常创伤愈合。本专利技术的一个实施方案是提供了减弱受试者眼中结締组织生长因子表 达的方法。该方法包括对受试者的眼施用组合物，该组合物包含有效量的 干扰RNA如19-49个核苷酸长度的双链(ds)siRNA或单链(ss)siRNA和可 药用的栽体。双链siRNA包含有义核苷酸序列、反义核苷酸序列和至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域。此外，在生理条件下，反义序列与对应于SEQIDNO: l(人结締组织生长因子DNA的有义链序列，Genebank 参考号为NMJ)01901)的mRNA的一部分杂交，并且具有至少19个核苷 酸的与对应于SEQ ID NO: 1的mRNA杂交部分至少接近完全连续互补 的区域。施用这种组合物可以减弱受试者眼中结締组织生长因子mRNA的 表达。单链siRNA具有19-49个核苷酸的长度，在生理条件下能与对应于 SEQ ID NO: 1的mRNA的起始于379、 691、 801、卯l、 932、 937、 969、 986、 1119、 1170、 1201、 1346、 1473、 1478、 1481、 1488、 1626、 1660 或1666位核苷酸的一部分杂交，并且具有能与对应于SEQ ID NO: l的 mRNA的杂交部分至少接近完全互补的区域。本专利技术的实施方案中，双链干扰RNA的反义链被设计为靶向对应于 SEQ ID NO: 1的mRNA起始于或包含379、 691、 801、 901、 932、 937、 969、 986、 1119、 1170、 1201、 1346、 1473、 1478、 1481、 1488、 1626、 1660或1666位核苷酸的核苷酸序列。本专利技术的另 一个实施方案是提供了在需要其的受试者中治疗结締組织 生长因子有关的眼科疾病的方法.该方法包括对受试者的眼施用包含有效 量的19-49个核苷酸的干扰RNA和可药用载体的组合物，这种干扰RNA 包含有义链、反义链和至少19个核苷酸的至少接近完全连续的互补区域。 反义序列在生理条件下与对应于SEQ ID NO: 1的mRNA的一部分杂交， 并且具有至少19个核苷酸的能与对应于SEQ ID NO: 1的mRNA杂交部 分至少接近完全连续互补的区域。以此治疗结締组织生长因子有关的眼科 疾病。附图简述附图说明图1A显示SITOXTM数据，与图IB的数据一起证明小梁网细胞转染 效率不是PHit的。以SITOXTM(Dharmacon)转染对照转染GTM3细胞。24 小时后用锥虫蓝排除法实验确定SITOX 培养物中剩余的活细胞数量， 以此反映相对转染效率。空心条形无转染；实心条形用SITOXTM。图IB显示GTM3细胞^LV的siRNA的SIGLO 图像，与图1A的 数据一起证明转染效率不是限速的。用LIPOFECTAMINE 2000TM将 SIGLO siRNA转染至GTM3细胞。24小时后用荧光显微术检测 SIGLO siRNA的^L^(红色不规则形状)'用DAPI(4'， 6-二脒基-2-苯基 吲咮)鉴定单个的细胞核(蓝色圆形区域)，DAPI是双链DNA的染料.如图 1A数据和图IB图像所示，几乎所有细胞或死亡(SITOXTM)或发出荧光 (SIGLO )。图2A是一个示意图，显示CTGF基因的外显子(方盒)和内含子(线条) 结构，以及siRNA Sl， S2， S3和QPCR引物/^^针组Ql和Q2相对于 Genebank CTGF序列NMJ)01卯1的位置，以SEQ ID NO: 1提供序列 NM_001901。在例1中提供了 siRNA和引物/探针组的序列。图2B显示用外显子5的引物/探针组Q2对CTGF mRNA进行QPCR 扩增。用SI和S4的siRNA，未检测到CTGF mRNA水平的明显下调。图2C显示用跨越外显子4/5的引物/探针组Ql对CTGF mRNA进行 QPCR。每种siRNA都能观察到CTGF mRNA的下调，而用S2 siRNA观 察到~90%的下调。图3显示用不同浓度的S2 siRNA检测CTGF mRNA水平下调的滴定 研究。用引物/探针组Ql通过QPCR扩增对CTGF mRNA的下调进行估 计。如实施例l所述，用O, 1, 3， 10， 30和100nM S2 siRNA处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
减弱受试者眼中结缔组织生长因子ｍＲＮＡ的表达的方法，其包括：　　　　对受试者的眼施用包含有效量的长度为１９到４９个核苷酸的干扰ＲＮＡ和可药用载体的组合物，该干扰ＲＮＡ包含：　　　　有义核苷酸序列、反义核苷酸序列，和至少１９个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域；　　　　其中反义序列在生理条件下与对应于ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的ｍＲＮＡ的一部分杂交，并且具有至少１９个核苷酸的与对应于ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的ｍＲＮＡ的杂交部分至少接近完全连续互补的区域，　　　　其中结缔组织生长因子ｍＲＮＡ的表达被减弱。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：AR谢帕德，彭玉豪，
申请(专利权)人：爱尔康公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]