一种负载亚单位疫苗的纳米粒微针及其制备方法技术

本发明专利技术属于医学领域，具体涉及一种负载亚单位疫苗的纳米粒微针及其制备方法。所述制备方法为：(I)制备纳米粒，并使纳米粒负载抗原和佐剂；(II)制备纳米粒微针，并使纳米粒成型于微针的针尖部位。本发明专利技术所述的制备方法，能够将抗原、佐剂等负载于纳米粒内部或表面，并使纳米粒成型于微针针尖部位，使得当纳米粒微针按压在皮肤上时，其可以刺穿皮肤角质层，将抗原和佐剂递送至皮肤，靶向到淋巴结，再被树突细胞摄取，抗原交叉呈递，并增加树突细胞CCR9的表达，引发树突细胞归巢至肠系膜淋巴结，从而实现肠粘膜免疫保护效果。即本发明专利技术采用皮肤途径接种粘膜疫苗，进而引发粘膜免疫的保护效果。果。果。

【技术实现步骤摘要】
一种负载亚单位疫苗的纳米粒微针及其制备方法


[0001]本专利技术属于医学领域，具体涉及一种负载亚单位疫苗的纳米粒微针及其制备方法。

技术介绍

[0002]幽门螺杆菌、沙门氏菌可引起肠道粘膜感染，粘膜疫苗则能在病原体感染的部位引发强大的保护性免疫反应。但是，粘膜疫苗研发具有很高的技术难度，这是由于病原体定植于肠道粘膜中，通过免疫系统阻止该菌的定植必须激发粘膜免疫应答，诱导有效的分泌性IgA(sIgA)分泌才能产生有效保护作用。
[0003]以往的研究认为，由于免疫细胞的活化存在组织局限性，通过呼吸道粘膜或口服等粘膜途径接种疫苗才能诱导粘膜局部产生sIgA和系统性免疫应答。然而，呼吸道粘膜组织微环境复杂，抗原分子易被大量酶类物质降解，且各类生理屏障(如支气管屏障、粘液屏障、免疫屏障及细胞膜屏障等)阻碍抗原分子到达效应靶点。口服疫苗需要面对胃肠道的恶劣环境(比如胃内的低pH值和肠道蛋白酶)，蛋白抗原极易受到破坏，降低了疫苗的免疫效果。也正是因为其递送效率低，目前上市的口服疫苗多为减毒活疫苗。其大规模使用还存在着热源去除不干净、病毒性恢复等安全隐患。通过传统的肌肉注射、皮下注射等外周注射疫苗方式活化的免疫细胞仅停留于系统性免疫系统中，难以引发粘膜免疫响应，不能有效地引发系统性免疫和肠道粘膜免疫的双重应答，这与免疫细胞向特定部位的归巢性能有关。
[0004]皮肤作为人体重要的免疫器官，在表皮层和真皮层中分布着大量抗原提呈细胞，主要是树突状细胞(Dendritic cells)及其未成熟亚型郎格汉斯细胞(Langerhans cells)，它们均可有效的摄取、处理和呈递外来抗原，并在迁移到引流淋巴结后有效激发免疫应答，因此活性表皮层和真皮层被认为是疫苗接种的最佳部位之一。但是，现阶段最主要障碍是皮肤表层角质层的屏障作用，使疫苗的大分子抗原物质难以通过皮肤表层而进入富含抗原提呈细胞的活性表皮层和真皮层，且如何通过经皮免疫途径实现肠道粘膜免疫仍未见报道。
[0005]故基于此，提出本专利技术技术方案。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术的方案是提供一种负载亚单位疫苗的纳米粒微针的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0007](I)纳米粒的制备：
[0008]制备纳米粒，并使纳米粒负载抗原和佐剂；
[0009](II)纳米粒微针的制备：
[0010](II
‑
1)将所述纳米粒与聚乙烯吡络烷酮水溶液混合，得到混合液；
[0011](II
‑
2)将所述混合溶液加入微针模具中，通过离心使混合液填充于微针模具的针尖部位；
[0012](II
‑
3)再向微针模具中加入不含纳米粒的聚乙烯吡络烷酮水溶液，形成微针背衬层；
[0013](II
‑
4)将微针模具进行干燥并脱模，即得到可溶型负载亚单位疫苗的纳米粒微针；
[0014]或
[0015](II
‑
a)将聚乙二醇二丙烯酸酯和包含光引发剂、所述纳米粒的二甲基亚砜混合，得到第一溶液；
[0016](II
‑
b)将聚乙二醇二丙烯酸酯和包含光引发剂的二甲基亚砜混合混合，得到第二溶液；
[0017](II
‑
c)将所述第一溶液加入至微针模具中，使所述第一溶液填充于微针模具的针尖部位；将所述第二溶液加入至微针模具中，使所述第二溶液填充于微针模具的背衬层；
[0018](II
‑
d)将所述微针模具置于紫外光下交联固化，脱模后即得到可溶胀型负载亚单位疫苗的纳米粒微针。
[0019]优选地，步骤(I)中，纳米粒的制备方法为：
[0020](I
‑
1)将抗原水溶液与包含高分子载体、佐剂的有机溶液进行混合，并超声处理，得到初乳液；
[0021](I
‑
2)将所述初乳液加入至聚乙烯醇水溶液中，并匀浆处理，得到复乳液；
[0022](I
‑
3)向所述复乳液中再次加入聚乙烯醇水溶液，搅拌后离心清洗(目的是去除有机溶剂，令其挥发)，即得到负载抗原和佐剂的纳米粒；
[0023]或
[0024](I
‑
a)将含有高分子载体、佐剂和表面活性剂的有机溶液与表面活性剂(如泊洛沙姆F127)水溶液进行混合，并超声处理，得到乳化液；
[0025](I
‑
b)对所述乳化液依次减压旋蒸、清洗、冻干，免疫前加入抗原水溶液进行搅拌，即得到负载抗原和佐剂的纳米粒。
[0026]优选地，所述抗原为重组幽门螺杆菌蛋白HpaA、重组幽门螺杆菌蛋白UreB1或沙门氏菌蛋白中的一种或多种的组合；所述高分子载体为聚乳酸
‑
羟基乙酸(PLGA)或明胶中的一种；所述佐剂为全反式维甲酸(atRA)或全反式维甲酸(atRA)与寡聚脱氧核苷酸链(CpG)的组合。
[0027]优选地，步骤(I
‑
1)中，所述抗原水溶液与所述佐剂有机溶液的体积比为1:3～1:10；所述抗原水溶液中，抗原的浓度为0.1～5mg/mL；所述有机溶液中，佐剂的浓度为0.01～5mg/mL，高分子载体的浓度为5～40mg/mL；所述超声处理的功率为20～200W，每个超声周期中，工作时间3～5s，间歇时间3～5s，超声总时间为1～30min。
[0028]优选地，步骤(I
‑
2)中，所述聚乙烯醇水溶液的浓度为1％；所述匀浆的转速为7400～7600r/min，匀浆的时间为14～16min。
[0029]优选地，步骤(I
‑
a)中，所述有机溶液中，高分子载体的浓度为5～40mg/mL，佐剂的浓度为0.1～15mg/mL，表面活性剂的浓度为0.1～10mg/mL；所述F127水溶液的浓度为0.5wt.％；所述超声处理的功率为120W。
[0030]优选地，步骤(I
‑
b)中，所述抗原水溶液的浓度为4mg/mL，所述搅拌时间为2～12h。
[0031]优选地，步骤(II
‑
a)中，每1mL所述第一溶液中，包含0.99mL所述聚乙二醇二丙烯
酸酯和0.01mL所述二甲基亚砜；所述二甲基亚砜中包含10mg/mL所述光引发剂和0.2～1mg所述纳米粒。
[0032]优选地，步骤(II
‑
d)中，所述紫外光的波长为365nm，功率为1～5W/cm2；所述交联固化的时间为2～3min。
[0033]基于相同的技术构思，本专利技术的再一方案是提供一种由上述制备方法得到的负载亚单位疫苗的纳米粒微针。
[0034]本专利技术的有益效果为：
[0035]本专利技术所述的制备方法，能够将抗原、佐剂等负载于纳米粒内部或表面，并使纳米粒成型于微针针尖部位，使得当纳米粒微针按压在皮肤上时，其可以刺穿皮肤角质层，将抗原和佐本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种负载亚单位疫苗的纳米粒微针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(I)纳米粒的制备：制备纳米粒，并使纳米粒负载抗原和佐剂；(II)纳米粒微针的制备：(II
‑
1)将所述纳米粒与聚乙烯吡络烷酮水溶液混合，得到混合液；(II
‑
2)将所述混合溶液加入微针模具中，通过离心使混合液填充于微针模具的针尖部位；(II
‑
3)再向微针模具中加入不含纳米粒的聚乙烯吡络烷酮水溶液，形成微针背衬层；(II
‑
4)将微针模具进行干燥并脱模，即得到可溶型负载亚单位疫苗的纳米粒微针；或(II
‑
a)将聚乙二醇二丙烯酸酯和包含光引发剂、所述纳米粒的二甲基亚砜混合，得到第一溶液；(II
‑
b)将聚乙二醇二丙烯酸酯和包含光引发剂的二甲基亚砜混合混合，得到第二溶液；(II
‑
c)将所述第一溶液加入至微针模具中，使所述第一溶液填充于微针模具的针尖部位；将所述第二溶液加入至微针模具中，使所述第二溶液填充于微针模具的背衬层；(II
‑
d)将所述微针模具置于紫外光下交联固化，脱模后即得到可溶胀型负载亚单位疫苗的纳米粒微针。2.根据权利要求1所述负载亚单位疫苗的纳米粒微针的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，纳米粒的制备方法为：(I
‑
1)将抗原水溶液与包含高分子载体、佐剂的有机溶液进行混合，并超声处理，得到初乳液；(I
‑
2)将所述初乳液加入至聚乙烯醇水溶液中，并匀浆处理，得到复乳液；(I
‑
3)向所述复乳液中再次加入聚乙烯醇水溶液，搅拌后离心清洗，即得到负载抗原和佐剂的纳米粒；或(I
‑
a)将含有高分子载体、佐剂和表面活性剂的有机溶液与表面活性剂水溶液进行混合，并超声处理，得到乳化液；(I
‑
b)对所述乳化液依次减压旋蒸、清洗、冻干，免疫前加入抗原水溶液进行搅拌，即得到负载抗原和佐剂的纳米粒。3.根据权利要求2所述负载亚单位疫苗的纳米粒微针的制备方法，其特征在于，所述抗原为重组幽门螺杆菌蛋白HpaA、重组幽门...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐俊骅，张丽，郭刚，刘开云，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：