通过光镊操控结合微电极传感实现单细胞形变过程中信号分子释放的实时监测方法技术

本发明专利技术涉及一种通过光镊操控结合微电极传感实现单细胞形变过程中信号分子释放的实时监测方法，包括如下步骤：得到只能容纳一个细胞大小的电活性区域的ITO薄膜微电极；制备可特异性响应信号分子浓度变化的工作电极；以工作电极作为底部，构建有三电极体系的电化学室；用生物分子修饰微球载体，并将其置于电化学室中；通过双光阱光镊分别捕获两个微球载体并与细胞接触，在工作电极区域拉伸或挤压细胞发生形变，测定细胞形变过程中的力谱信息以及形变量；使用电化学工作站实时监测细胞形变过程中释放的信号分子浓度变化。本方法可用于研究机械力刺激下单细胞释放化学信息的变化与细胞力学信息的关系。细胞力学信息的关系。细胞力学信息的关系。

【技术实现步骤摘要】
通过光镊操控结合微电极传感实现单细胞形变过程中信号分子释放的实时监测方法


[0001]本专利技术属于光镊操纵
，也属于生物电化学传感领域，其包含生物物理、分子生物学、纳米生物技术和微电极电化学等交叉
，具体涉及一种通过光镊操控结合微电极传感实现单细胞形变过程中信号分子释放的实时监测方法。

技术介绍

[0002]光镊最早由Ashkin于1986年专利技术，它又称为单光束梯度力光阱，是利用聚焦高斯激光光场强度空间变化形成的梯度力把微粒稳定地捕获在光场最强处，即光束的焦点位置，当激光束移动时就可以带动微粒一起运动，实现对微粒的精密操控。与在宏观上拉伸或挤压细胞的方式相比，光镊以高聚焦激光捕获微球充当手柄可以在单细胞水平施加不同大小和方向的力进行机械刺激。而且光镊是以非侵入性操纵细胞形变，不仅实现了细胞保持在正常的生理活性下精确控制微观状态下的机械力，还能达到pN级的高力学分辨率以及ms级高时间分辨率。因此，光镊是在单细胞水平研究细胞形变过程中力学变化的普适性工具。
[0003]微电极是指至少在一维尺度上低于25μm的电极，与传统电极相比，其具有多种优势，如尺寸小、响应快速、电流密度高、信噪比高、IR降小、易达到稳态、传质速度快等，从而可实现高时空分辨率、高灵敏度的检测。微电极中的平面电极阵列电极的出现及应用为细胞高通量检测提供了可能，细胞直接覆盖在电极表面，无需靶标标记、无需微操作系统，使检测效率大大提高，且利用微加工技术可在电极材料、形貌及尺寸可控基础上实现批量制备。在微电极表面进行修饰之后可以用来实现高选择性和高灵敏检测细胞和活体中神经递质类物质的含量以及一些NO、CO等关键信号分子。因此，微电极电化学传感技术可广泛应用于活体分析、生物传感、生物细胞检测等各个领域，进行实时，高分辨率、高特异性的检测。
[0004]细胞作为生命体结构和功能的基本单元，其每时每刻都在释放各种信号分子进行胞间通讯与信号转导，以此协调整体生命活动。而细胞在力学作用下发生的形变将会影响其信号转导与分子释放过程，进而调控细胞增殖、分化、代谢、应激、防御和凋亡等重要的生理活动。细胞释放的信号分子主要分为内分泌激素、旁分泌与自分泌因子、神经递质及气体信号小分子等四类。除了内分泌激素作用距离远、时效久外，其他信号分子通常作用于自身或附近的靶细胞，因此对这些信号分子释放的实时监测具有重要的生理意义。
[0005]目前尚缺乏一种在单细胞水平实时监测细胞形变的受力情况与信号分子动态释放响应关系的方法，本专利技术将光镊操纵技术和微电极电化学传感技术相结合，使用聚苯乙烯微球作为光镊手柄使细胞发生形变，再通过在微电极表面修饰可以响应信号分子变化的电极材料来实时监测信号分子的释放情况，在单细胞水平研究机械应力对内皮细胞、巨噬细胞和神经细胞等的影响，在细胞形变方面做出贡献。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种通过光镊操控结合微电极传感实现单细胞形变过程
中信号分子释放的实时监测方法，针对现有的研究难以在不损伤细胞的情况下对单个正常细胞进行机械拉伸/挤压和精准测力，并存在时空分辨率不高的问题，本专利技术将微电极电化学传感技术与光镊技术相结合，首次实现了双光阱光镊拉伸或挤压无靶标标记的正常细胞，并对光镊作用下细胞释放信号分子浓度的变化进行实时监测，研究细胞形变过程中形变量与力谱信息和信号分子释放的关系。因此，本专利技术提供了一种将光镊与无需靶标标记的电化学传感技术相结合，实现单个细胞的拉伸或挤压，并在高时空分辨率下实时监测细胞释放信号分子情况与细胞形变的策略，为机械作用刺激单细胞形态和生理的变化提供了一种普适性的思路。
[0007]本专利技术实现目的所采用的方案是：一种通过光镊操控结合微电极传感实现单细胞形变过程中信号分子释放的实时监测方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0008](1)制备只能容纳一个细胞大小的电活性区域的ITO薄膜微电极；
[0009](2)对暴露电化学活性区域的ITO薄膜微电极按信号分子的特性，使用化学修饰法制备可特异性响应信号分子浓度变化的工作电极；
[0010](3)以工作电极作为底部，构建有三电极体系的电化学室，用于容纳细胞及细胞培养液；
[0011](4)用生物分子修饰微球载体，并将其置于电化学室中；
[0012](5)通过双光阱光镊分别捕获两个微球载体并与细胞接触，在工作电极区域拉伸或挤压细胞发生形变，测定细胞形变过程中的力谱信息以及形变量；
[0013](6)使用电化学工作站实时监测细胞形变过程中释放的信号分子浓度变化。
[0014]优选地，所述步骤(1)中，通过磁控溅射ITO薄膜，再使用负光刻胶进行光刻，得到只能容纳一个细胞大小的电活性区域的ITO薄膜微电极，负光刻胶为SU
‑
8 2000.5、NRD6015、HD 4100中的至少一种，使用光刻技术反复光刻、多次钝化非电活性部位的ITO薄膜电极，得到只能容纳一个细胞大小的电活性区域的ITO薄膜微电极。
[0015]多次光刻钝化ITO玻片使得微电极的电活性部位只能监测到单个细胞的信号分子释放情况。
[0016]所述细胞为能够使用双光阱光镊进行机械拉伸的所有细胞系，包括但不限于人心肌细胞(AC16细胞)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)、小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞(NG108
‑
15细胞)、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)、小鼠海马神经元细胞(HT22细胞)。
[0017]优选地，所述步骤(2)中，ITO薄膜微电极上可以根据要特异性检测的信号分子以不可逆吸附、共价连接或自组装技术化学修饰不同的电极材料；优选地，所述信号分子为作用于细胞自身或附近靶细胞的可以使用电化学法检测的分子；优选地，所述信号分子为包括气体信号小分子、旁分泌或自分泌因子和神经递质中的至少一种。
[0018]气体信号小分子为NO、CO、H2S中的至少一种，旁分泌或自分泌因子为生长因子、细胞因子中的至少一种，神经递质为乙酰胆碱、谷氨酸中的至少一种。
[0019]优选地，所述电极材料包括纳米材料(纳米颗粒、纳米管和纳米线)、膜材料(Nafion)、电活性聚合物(PEDOT)、金属卟啉类分子、酶等通过不可逆吸附、共价连接或自组装技术修饰微电极。
[0020]优选地，具体的包括以贵金属纳米颗粒修饰ITO电极来响应具有氧化还原特性的
小分子、以谷氨酸氧化酶修饰ITO电极来响应不具备电化学活性的神经递质中的至少一种。
[0021]优选地，所述步骤(3)中，以工作电极作为底部，以顶部打有孔洞的PDMS薄膜作为容纳细胞培养液的腔室，通过孔洞插入对电极和参比电极，构成具有三电极体系的电化学室。
[0022]优选地，所述步骤(4)中，微球载体为聚苯乙烯微球或二氧化硅微球，生物分子包括刀豆蛋白、转铁蛋白
‑
生物素、整合素、叶酸中的至少一种。
[0023]优选地，所述步骤(5)中，所述细胞为贴壁状态本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过光镊操控结合微电极传感实现单细胞形变过程中信号分子释放的实时监测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备只能容纳一个细胞大小的电活性区域的ITO薄膜微电极；(2)对暴露电化学活性区域的ITO薄膜微电极按信号分子的特性，使用化学修饰法制备可特异性响应信号分子浓度变化的工作电极；(3)以工作电极作为底部，构建有三电极体系的电化学室，用于容纳细胞及细胞培养液；(4)用生物分子修饰微球载体，并将其置于电化学室中；(5)通过双光阱光镊分别捕获两个微球载体并与细胞接触，在工作电极区域拉伸或挤压细胞发生形变，测定细胞形变过程中的力谱信息以及形变量；(6)使用电化学工作站实时监测细胞形变过程中释放的信号分子浓度变化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，通过磁控溅射ITO薄膜，再使用负光刻胶进行光刻，得到只能容纳一个细胞大小的电活性区域的ITO薄膜微电极，负光刻胶为SU
‑
8 2000.5、NRD6015、HD 4100中的至少一种，使用光刻技术反复光刻、多次钝化非电活性部位的ITO薄膜电极，得到只能容纳一个细胞大小的电活性区域的ITO薄膜微电极。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，ITO薄膜微电极上可以根据要特异性检测的信号分子以不可逆吸附、共价连接或自组装技术化学修饰不同的电极材料；优选地，所述信号分子为作用于细胞自身或附近靶细胞的可以使用电化学法检测的分子；优选地，所述信号分子为...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐宏武，李煜垚，刘浏，徐大地，李江涛，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：