一种猪圆环病毒2型抗体管式化学发光免疫检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提出了一种猪圆环病毒2型抗体管式化学发光免疫检测试剂盒，包括磁珠工作液、酶标抗体工作液、稀释液、底物溶液、标准品、质控品和洗涤液；磁珠工作液中，磁珠与PCV2重组蛋白偶联；酶标抗体工作液为碱性磷酸酶标记的兔抗猪IgG抗体；本发明专利技术还提出了试剂盒的使用方法。综上，本发明专利技术试剂盒采用化学发光酶免疫分析法中的间接法为原理构建，检测血清样本中的抗体，检测过程稳定、检测结果精准，实现定量、自动化检测，可作为观察疗效及愈后情况的指标，同时能够监测疫苗是否产生反应。同时能够监测疫苗是否产生反应。同时能够监测疫苗是否产生反应。

【技术实现步骤摘要】
一种猪圆环病毒2型抗体管式化学发光免疫检测试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及化学发光检测
，尤其涉及一种猪圆环病毒2型抗体管式化学发光免疫检测试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒病(Porcine circo virus disease,PCVD)是由猪圆环病毒(Porcine circo virus，PCV)引起的免疫抑制性疾病，可感染多种动物，如牛、羊、犬类、老鼠等。其中，家猪、野猪为主要宿主，各品种、年龄段猪都易感，对仔猪危害更严重。猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病的主要病原，传染性强，发病率高，分布范围广，常与其他病毒混合感染，疾病可引起可引起多种相关疾病，包括断奶仔猪衰竭多系统综合症、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、仔猪先天性震颤以及繁殖障碍等，有研究指出，2010年
‑
2020年，国内外PCV2阳性率可达53.02％，给猪养殖业造成巨大损失。自20世纪90年代末发现PCV2以来，迅速席卷世界各猪养殖国家。由于PCV2基因型不断发生变异并出现基因重组，传统疫苗保护力受到影响，且猪圆环病毒属于条件性致病病毒，传播途径十分广泛，大部分猪场长期隐性带毒，当环境变化，猪抵抗力减弱，极易发病，此时传播速度快，防控难度大，因此，快速、准确地检测PCV2对疾病的防控具有重要意义。
[0003]化学发光免疫分析技术(chemiluminescence immunoassay,CLIA)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。化学发光免疫分析的敏感性和信噪比高，背景荧光信号低，可以在很宽的线性范围内检测极低浓度的分析物，能够通过发光检测仪器定量分析被检样品等诸多优点而在生命科学的各领域广应用，例如检测艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、检测肿瘤标记物等。
[0004]公开号为CN 114594255 A的专利中公开了一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒，但是该技术检测的是猪圆环病毒2型抗原。
[0005]论文：猪圆环病毒2型检测技术研究及试剂盒开发.陶思锐，浙江理工大学，硕士学位论文。论文中公开了对猪圆环病毒2型磁珠化学发光抗原检测试剂盒进行研发，检测的也是猪圆环病毒2型抗原。
[0006]抗原检测通常检测体内是否存在相关抗原，能够检测血液当中的细胞组织是否存在病原微生物感染的情况。如果抗原检测结果为阳性，通常说明机体可能存在相应的感染情况。如果检测结果为阴性，则说明暂未受到感染。
[0007]抗体检测主要目的在于提高临床诊断的准确率，可作为观察疗效及愈后情况的指标。也能够监测疫苗是否产生反应，比如注射疫苗后没有产生相应抗体，意味着疫苗注射失败。疫苗注射失败者，可根据检测结果，重新补打疫苗，不会错过最佳注射时间。
[0008]因此，公开号为CN 114594255 A的专利以及上述论文中的技术，均不能对临床诊
断的准确率以及疫苗是否产生反应作出判断。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本专利技术提出了一种猪圆环病毒2型抗体管式化学发光免疫检测试剂盒及其使用方法，试剂盒采用化学发光酶免疫分析法中的间接法为原理构建，检测血清样本中的抗体，检测过程稳定、检测结果精准，实现定量、自动化检测，可作为观察疗效及愈后情况的指标，同时能够监测疫苗是否产生反应。
[0010]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0011]一方面，本专利技术提供了一种猪圆环病毒2型抗体管式化学发光免疫检测试剂盒，包括磁珠工作液，酶标抗体工作液、稀释液、底物溶液、标准品、质控品和洗涤液。
[0012]上述酶标抗体工作液为碱性磷酸酶标记的兔抗猪IgG抗体，最佳稀释倍数1：20000。碱性磷酸酶与底物反应使底物发光，本身不损耗，发光信号强，发光时间长。碱性磷酸酶标记的兔抗猪IgG抗体为二抗，为了与待检血清中的抗体结合。
[0013]上述稀释液为1倍的PBST。
[0014]上述底物溶液为纯度为99.5％的AMPPT。底物作用是在酶的作用下转为激发态，趋于稳定态过程中产生光子。
[0015]上述标准品为采用标准品稀释液进行梯度稀释的高免PCV2阳性血清。
[0016]上述洗涤液为25倍浓缩洗涤液，成分包括丁二酸1.98g、六水丁二酸钠62.16g、NaCl 225g、Tween
‑
20 13.75ml。
[0017]上述磁珠工作液的制备方法包括以下步骤：
[0018]S1磁珠活化
[0019]选用粒径为2.5
‑
3.5μm、带有羧基的磁珠，将2
‑
3mg磁珠，用0.5
‑
1.5ml的pH为5.0的MES缓冲液清洗，定容到250μl MES缓冲液中，分别加入20
‑
30μl质量浓度为10mg/ml的1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)与N
‑
羟基丁二酰亚胺(NHS)，20
‑
25℃条件下，涡旋振荡30
‑
40min，使磁珠活化。(EDC与NHS均为羧基活化剂，能够增加偶联反应的效率)
[0020]S2活化磁珠与PCV2重组蛋白偶联
[0021]活化后的全部磁珠，使用pH为5.0的MES缓冲液清洗，并定容至250μl，加入50
‑
60μg的PCV2重组蛋白(Cap)，20
‑
25℃条件下，涡旋振荡3
‑
4h，使PCV2重组蛋白包被在磁珠上，得到偶联有PCV2重组蛋白(Cap)的磁珠混悬液。
[0022]S3封闭未结合抗原的位点
[0023]所得磁珠混悬液用pH为5.0的MES缓冲液清洗，定容至250μl，加入50μl体积浓度为10％的BSA封闭液，室温涡旋振荡2
‑
3h，封闭磁珠表面未结合抗原的位点。磁珠混悬液用MES缓冲液清洗后，保存于磁珠稀释液(含0.1％proclin
‑
300的PBS缓冲液)中，即可得到磁珠工作液。
[0024]另一方面，本专利技术还提供了上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0025]第一步：取8
‑
13μl猪血清放入重庆科斯迈生物科技有限公司的全自动化学发光免疫分析仪中，并通过分析仪自动吸取上述磁珠工作液20
‑
30μl，稀释液(1
×
PBST)50
‑
60μl，35
‑
40℃条件下孵育12
‑
18min，采用上述洗涤液清洗4次；得到反应液一；该步骤主要是将猪血清中的抗体与磁珠上的PCV2重组蛋白结合。
[0026]第二步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型抗体管式化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：包括磁珠工作液、酶标抗体工作液、稀释液、底物溶液、标准品、质控品和洗涤液；所述磁珠工作液中，磁珠与PCV2重组蛋白偶联；所述酶标抗体工作液为碱性磷酸酶标记的兔抗猪IgG抗体。2.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体管式化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体工作液的最佳稀释倍数1：20000；所述兔抗猪IgG抗体为二抗。3.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体管式化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述稀释液为1倍的PBST。4.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体管式化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述底物溶液为纯度为99.5％的AMPPT。5.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体管式化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为25倍浓缩洗涤液，成分包括丁二酸1.98g、六水丁二酸钠62.16g、NaCl 225g、Tween
‑
20 13.75ml。6.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体管式化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述磁珠工作液的制备方法包括以下步骤：S1磁珠活化选用粒径为2.5
‑
3.5μm、带有羧基的磁珠，将2
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3mg磁珠，用0.5
‑
1.5ml的pH为5.0的MES缓冲液清洗，定容到250μlMES缓冲液中，分别加入20
‑
30μl质量浓度为10mg/ml的EDC与NHS，20
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25℃条件下，涡旋振荡30
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40min，使磁珠活化；S2活化磁珠与PCV2重组蛋白偶联活化后的全部磁珠，使用pH为5.0的MES缓冲液清洗，并定容至250μl，加入50
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60μg的PCV2重组蛋白，20
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25℃条件下，涡旋振荡3
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【专利技术属性】
技术研发人员：罗胜军，林密，温肖会，包艳芳，连聪，蒋韬，宋帅，李涛善，向国庆，潘晓乐，吕殿红，贾春玲，牛瑞辉，
申请(专利权)人：兰州兽研生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：