一种甲基化富集蛋白及其编码基因、制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种甲基化富集蛋白，属于分子生物学领域。所述甲基化富集蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。本发明专利技术还进一步公开了所述甲基化富集蛋白的基因，包含所述基因的载体和宿主细胞，以及所述甲基化富集蛋白的制备方法和在制备用于富集甲基化DNA的试剂盒中的应用。本发明专利技术的甲基化富集蛋白纯化效率高，对甲基化DNA的富集效率高，特异性强，敏感度高，具有非常重要的临床应用价值。具有非常重要的临床应用价值。具有非常重要的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种甲基化富集蛋白及其编码基因、制备方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体地，涉及一种甲基化富集蛋白及其编码基因、制备方法和应用。

技术介绍

[0002]DNA甲基化(DNA methylation)为DNA的一种表观调控修饰，可以在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
[0003]MBD(methyl
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CpG
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binding domain)家族蛋白是最早发现的甲基化DNA结合蛋白，该家族蛋白主要包括MeCEP2和MBD1、MBD2、MBD3、MBD4这几个主要成员。在人体内，MBD家族蛋白均包含MBD结构域和其他功能域，通过招募不同的共抑制复合体到目标基因的甲基化位点，抑制目标基因的表达。同时，利用MBD家族蛋白能够特异性地结合甲基化的DNA的特性，在基因组DNA样本中去下拉或捕获甲基化的DNA片段，从而达到富集或纯化的效果，并结合荧光定量PCR检测(qPCR)及下一代测序(NGS)技术检测样本区域或者整体的甲基化水平。
[0004]目前利用MBD家族蛋白进行DNA甲基化富集的方法由于蛋白纯化表达效率低，产量低，成本高，因此使用起来并不普遍。同时，相对其他甲基化富集方式，现有的蛋白序列设计所表达的蛋白富集效率低，特异性差，敏感度低，不能用于临床检测试剂盒中。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题中的至少一个，本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]本专利技术第一方面提供一种甲基化富集蛋白，其氨基酸序列序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
[0007]在本专利技术中，SEQ ID No.3是在SEQ ID No.2的基础上优化改造得到的，SEQ IDNo.2所示的序列是MBD2蛋白中MBD结构域序列。具体地，通过在SEQ ID No.2前后各延长5
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6个氨基酸得到SEQ ID No.3，对应的蛋白质结构更接近其自然状态，肽链之间结构更为紧凑，同时，也使得甲基化功能区能够更好地去结合甲基化DNA中CpG岛，进而能够更好的提高甲基化富集效率。
[0008]进一步地，SEQ ID No.4是在SEQ ID No.3的基础上进一步优化得到的，具体地，在SEQ ID No.3的N端和C端加入一段特定的氨基酸序列，这两端序列主要功能是在稳定甲基化结合蛋白功能的同时提高其表达纯化效率，还能够给蛋白结构提供一定的灵活性，能够使其能更好地添加后续的纯化及磁珠标签。
[0009]本专利技术第二方面提供编码本专利技术第一方面所述一种甲基化富集蛋白的基因，包括SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，其中，SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，SEQ ID No.7所示的核苷酸序列编码SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
[0010]在本专利技术的一些实施方案中，所述甲基化富集蛋白还包括功能标签，相应地，所述基因还包括用于表达所述功能标签的序列。
[0011]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述功能标签为用于纯化的标签和/或用于检测的标签。在本专利技术的一些优选实施方案中，所述用于纯化的标签选自包括NH标签和His标签的组中的至少一种；所述功能标签选自包括Avi标签和Fc标签的组中的至少一种。在本专利技术的一些更优选的实施方案中，所述功能标签由用于检测的标签和用于纯化的标签共同组成。其中，所述用于检测的标签利用亲和、杂交或其他任意特异性识别性能富集目标物质。
[0012]在本专利技术的一些优选实施方案中，所述NH标签的氨基酸序列为HNHNHNHNHNHN。
[0013]在本专利技术的一些优选实施方案中，所述His标签的氨基酸序列为HHHHHH。
[0014]在本专利技术的一些优选实施方案中，所述Avi标签的氨基酸序列为GLNDIFEAQKIEWHEPGAAGHNHNHNHNHNHN。
[0015]在本专利技术的一些优选实施方案中，所述Fc标签的氨基酸序列为MKWVTFLLLLFVSDSAFS和PGAAGAGSDQEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK，分别添加在所述甲基化富集蛋白的N端和C端。
[0016]本专利技术第三方面提供一种表达载体，包括本专利技术第二方面所述的基因的序列。
[0017]在本专利技术的一些实施方案中，所述表达载体为原核表达载体，例如pET
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28a(+)载体。
[0018]本专利技术第四方面提供一种宿主细胞，包括本专利技术第三方面所述的表达载体。
[0019]在本专利技术的一些实施方案中，所述宿主细胞为原核细胞，例如大肠杆菌。
[0020]本专利技术第五方面提供一种制备本专利技术第一方面所述的一种甲基化富集蛋白的方法，包括诱导本专利技术第四方面所述宿主细胞进行表达的步骤。
[0021]在本专利技术的一些实施方案中，所述表达载体为pET
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28a，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0022]在本专利技术的一些实施方案中，诱导宿主细胞进行蛋白表达的步骤为：
[0023]S1，用含50μg/mL卡那霉素的LB培养基37℃培养所述大肠杆菌，
[0024]S2，当大肠杆菌培养液OD600至0.5
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0.7时，用终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件为：16℃，转速220rpm，过夜；
[0025]S3，将培养液于6000rpm离心5min，收集菌体；
[0026]S4，破碎菌体后进行蛋白纯化。
[0027]本专利技术第六方面提供本专利技术第一方面所述的一种甲基化富集蛋白在制备用于富集甲基化DNA的试剂盒中的应用。
[0028]本专利技术第七方面提供一种用于富集甲基化DNA的试剂盒，包括本专利技术第一方面所述的一种甲基化富集蛋白。
[0029]本专利技术的有益效果
[0030]相对于现有技术，本专利技术具有以下技术效果：
[0031]本专利技术的甲基化富集蛋白纯化效率高，对甲基化DNA的富集效率高，特异性强，敏感度高，具有非常重要的临床应用价值。
[0032]本专利技术的甲基化富集蛋白在His标签
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Ni/Co磁珠；NH标签
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甲基化富集蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。2.编码权利要求1所述一种甲基化富集蛋白的基因，其特征在于，包括SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，还包括用于表达功能标签的序列。4.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求2或3所述的基因的序列。5.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求3所述的表达载体。6.一种制备权利要求1所述的一种甲基化富集蛋白的方法，包括诱导权利要求5所述宿主细胞进行表达的步骤。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pET
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【专利技术属性】
技术研发人员：夏鹏，
申请(专利权)人：汲迈生命科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：