非洲猪瘟病毒结构蛋白p17特异性单克隆抗体的制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了非洲猪瘟病毒结构蛋白p17特异性单克隆抗体的制备和应用。通过原核表达的非洲猪瘟病毒结构蛋白p17制备出单克隆抗体，并鉴定该抗体所对应的抗原表位为

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒结构蛋白p17特异性单克隆抗体的制备和应用


[0001]本专利技术属于医学和生物学
，具体涉及非洲猪瘟病毒结构蛋白p17特异性单克隆抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]据了解，单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要技术，其在蛋白质的结构与功能研究方面、在人类和动植物的免疫学诊断方面都发挥着无可代替的重要作用。单克隆抗体在疾病预防、临床治疗、疾病诊断及检测中均有众多应用，同时单克隆抗体在生物学研究领域作为研究工具也得到广泛使用。非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的的高度传染性、烈性猪出血性疾病，猪感染后发病急、死亡率接近100％。ASFV是一种大型DNA病毒，主要在巨噬细胞中复制。该病毒自然宿主包括家猪、野猪和软蜱。ASF给我国养猪业造成了严重经济损失。直到目前，尚无有效针对ASF的疫苗和特效药，防控主要依赖于快速检测与早期诊断。
[0003]ASFV编码多达150多种蛋白。其中，p17蛋白作为ASFV主要的结构蛋白，与结构蛋白p72、p30、p54等蛋白一样，也具备良好的免疫原性。近年来，随着对ASFV诸多蛋白的研究深入，p17蛋白的重要性逐渐显现。因此，针对于p17蛋白的深入研究很有必要。
[0004]p17蛋白是病毒前体膜形成二十面体过程中所必需的蛋白。ASFV的组装始于内质网病毒前体膜的出现，之后通过衣壳层累进组装形成二十面体中间体与二十面体衣壳。在病毒组装早期阶段，内膜是开放的结构，具有各种形态，骨架蛋白M1249L、penton核心(五邻体蛋白体H240R/p49)和p17可以在内膜上移动。在p17蛋白引导下，骨架蛋白M1249L和p17加速“拉链”结构的形成，这些“拉链”结构将相邻的penton五邻体连接起来，形成一个多面体框架。p17、M1249L、H240R/p49形成的骨架，构成了ASFV的内衣壳。内衣壳对p72外衣壳二十面体形状的维持起到了至关重要的作用。
[0005]ASFV衣壳由17280个蛋白组成，包括主要衣壳蛋白p72和四个次要衣壳蛋白(p17、M1249L、H240R、p49)。p17蛋白含量比较丰富。每个ASFV壳粒中，三个p17蛋白围绕着一个p72三聚体蛋白，将p72蛋白牢牢地锚定在病毒内膜上。正二十面体结构包括20个三边体(每个三边体含120个壳粒)和12个五边体(每个五边体含30个壳粒和12个特殊的五邻体H240R/p49壳粒)。合计共有2772个壳粒。M1249L蛋白作为拉链蛋白，沿着连接两个相邻三边体的边缘运行，并与次要其他衣壳蛋白形成广泛的分子间网络，推动衣壳框架的形成。M1249L与p17、p72蛋白广泛结合形成“拉链”结构，以头对头的方式紧密连接，构成衣壳骨架。然而，“拉链”结构中p17蛋白与三边体中壳粒p17蛋白构象不同，两对“拉链”p17蛋白在准等效双轴处形成双套索结构，边缘处p17蛋白与M1249L紧密缠绕，极大促进了衣壳蛋白沿M1249L骨架的结合，保证“拉链”结构的正确装配。
[0006]p17的编码基因为ORF D117L，由117个氨基酸组成。蛋白预测大小为13.1kD，在ASFV感染细胞中实际观测分子量为17kD，而在真核表达载体、p17重组嵌合病毒中分子量大小略有不同，为23kD左右。p17是ASFV表达的晚期跨膜蛋白，位于病毒衣壳与内膜中，是ASFV
的主要结构蛋白之一。
[0007]p17对于病毒活力至关重要。当p17表达受抑制时,多聚蛋白pp220和pp62的水解加工被阻断，pp220和pp62无法被切割成为成熟的病毒蛋白，不能组装到含DNA的类核核心壳中，导致病毒组装成核心壳缺陷的二十面体颗粒，影响病毒感染能力。
[0008]p17为Ⅱ型跨膜蛋白，N端1
‑
38位氨基酸为膜外区，中间第39
‑
60位氨基酸为跨膜区，C端61
‑
117位氨基酸为膜内区。p17蛋白的跨膜结构域为功能域；最新研究发现，p17跨膜结构域能够与抗病毒蛋白STING结合，抑制STING下游细胞信号转导，阻碍干扰素(IFN)产生，继而进行免疫逃逸。另外，Xia等研究发现，p17还可以通过内质网应激和活性氧(ROS)介导的细胞周期阻滞来抑制细胞增殖。Zhong等通过免疫共沉淀、激光共聚焦实验发现，p17与线粒体外膜蛋白TOMM70(translocase of outer mitochondrial membrane 70)、热休克蛋白HSPA8(heat shock 70kDa protein 8)存在相互作用，这为进一步研究p17在ASFV感染细胞中发挥的功能奠定了重要基础。
[0009]AFSV的多种蛋白均能刺激机体产生中和性抗体，一般每个蛋白存在多个中和性抗体识别位点，也存在不同的中和机制。因此，可通过重组蛋白获得的相应特异单克隆抗体对ASFV进行中和实验，抑制病毒增殖。Fan等通过间接ELISA实验证实，p17具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生针对于ASFV p17蛋白的特异性抗体。但当p17与其他ASFV蛋白如p30、p22、p54等组成融合蛋白联合进行免疫时，会影响针对p17蛋白的抗体滴度，因此，采用p17蛋白单独进行免疫的效果要优于多种蛋白联合免疫产生的效果。另外，至今未有使用p17蛋白单克隆抗体进行中和实验的研究，p17诱导的特异性抗体是否为中和性抗体还有待进一步探究。
[0010]鉴于p17蛋白在ASFV感染中发挥的重要作用，需要提供一种能够弥补ASFV结构蛋白p17工业化抗体的空白，同时探索检测诊断ASFV的新方法。

技术实现思路

[0011]本专利技术针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种非洲猪瘟结构蛋白p17特异性单克隆抗体的制备和应用，使用细胞融合杂交瘤技术制备非洲猪瘟结构蛋白p17特异性单克隆抗体，并将制备的非洲猪瘟结构蛋白p17特异性单克隆抗体成功应用于各种免疫学试验，基于制备的单克隆抗体及其抗原表位肽建立了检测非洲猪瘟结构蛋白p17抗体的间接与竞争ELIS检测方法，可用于商品化试剂盒的开发。
[0012]本专利技术的技术方案之一在于，提供了非洲猪瘟病毒结构蛋白p17单克隆抗体的制备，所述非洲猪瘟病毒结构蛋白p17单克隆抗体由杂交瘤细胞株ASFV p17
‑
1G2产生，所述杂交瘤细胞株ASFV p17
‑
1G2的保藏编号为CCTCC NO:C2023165。
[0013]本专利技术的技术方案之二在于，提供了非洲猪瘟病毒结构蛋白p17的抗原表位，通过所述抗原表位可以特异性识别非洲猪瘟病毒结构蛋白p17。
[0014]上述抗原表位为非洲猪瘟病毒结构蛋白p17的68
‑
78肽段或67
‑
79肽段，其氨基酸序列为
68
SSIPKPPPSYY
78
或/和
67
KSSIPKPPPSYYV
79
。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.非洲猪瘟病毒结构蛋白p17单克隆抗体的制备，其特征在于：所述非洲猪瘟病毒结构蛋白p17单克隆抗体由杂交瘤细胞株ASFV p17
‑
1G2产生，所述杂交瘤细胞株ASFV p17
‑
1G2的保藏编号为CCTCC NO:C2023165。2.如权利要求1所述非洲猪瘟病毒结构蛋白p17的抗原表位，其特征在于：通过所述抗原表位可以特异性识别非洲猪瘟病毒结构蛋白p17。3.根据权利要求2所述非洲猪瘟病毒结构蛋白p17的抗原表位，其特征在于：所述抗原表位为非洲猪瘟病毒结构蛋白p17的68
‑
78肽段或67
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79肽段，其氨基酸序列为
68
SSIPKPPPSYY
78
或/和
67
KSSIPKPPPSYYV
79
。4.如权利要求1所述非洲猪瘟病毒结构蛋白p17单克隆抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱建中，曹琦，张佳佳，张凯莉，郑王龙，陈南华，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：