肝素钠中多硫酸软骨素的琼脂糖凝胶电泳检测方法技术

本发明专利技术公开了肝素钠中多硫酸软骨素的琼脂糖凝胶电泳检测方法，根据多硫酸软骨素与肝素钠分子结构不同的特点，通过硝化反应使肝素钠降解，而多硫酸软骨素不容易降解，在电泳检测中被检出。本发明专利技术采用琼脂糖凝胶电泳实现了对肝素钠中含量较低的多硫酸软骨素的检测，灵敏度达到０．５％以上，电泳图谱清晰，分辨率高，观察直观，容易判断，重复性好。电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定，且制成干膜可长期保存。本发明专利技术操作简单，电泳速度快。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及肝素钠中多硫酸软骨素的琼脂糖凝胶电泳检测方 法。
技术介绍
我国是肝素钠产量最大的国家，国际市场的肝素钠产品原料70%以上均来自中 国。随着需求的增加，这几年肝素钠的价格一路攀升。2008年2月，美国因注射肝素钠出 现4例死亡，多例不良反应的医疗事故，成为震惊世界的“肝素钠事件”。经有关专家分析， 上述事故可能是因为与肝素钠中含有多硫酸软骨素有关联。我国政府十分重视并关注事态 发展，针对市场中存在部分肝素钠中含多硫酸软骨素情况，国家药监局召开专门会议，要求 加强管理，一律召回含有多硫酸软骨素的肝素钠。因此，对肝素钠中多硫酸软骨素进行检测 已经成为迫在眉睫的事。目前，行业内肝素钠中多硫酸软骨素的检测，一般采用核磁共振法，醋酸纤维素薄 膜电泳法。核磁共振法检测设备投入较大，而且多硫酸软骨素含量少于时也不易被检 出。而醋酸纤维素薄膜电泳检测法，分离效果差，容易受其它杂质干扰，薄膜不透明，不易于 观察，通常肝素钠中多硫酸软骨素的含量大于5%时，电泳检测效果明显，而当多硫酸软骨 素小于3%时电泳检测结果不容易辨别。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种肝素钠中多硫酸软骨素的琼脂糖凝胶电泳 检测方法，克服现有技术存在的缺陷，即使肝素钠中的多硫酸软骨素含量少于也能被检 出，本专利技术检测结果容易观察，分辨率高，检测灵敏度高。本专利技术采取以下技术方案予以实现，包括下列步骤(1)样品溶解取相同重量的不含多硫酸软骨素的肝素钠粗品、含有重量低于 多硫酸软骨素的肝素钠粗品、肝素钠标准品、多硫酸软骨素标准品，分别溶解于水中，每毫 升溶液中含样品5-20mg ；(2)硝化对步骤(1)得到的四种水溶液，分别加酸调PH至1-3，然后用亚硝酸盐 或硝酸盐进行硝化反应0. 5-2小时，再用碱调PH至6. 5-7. 5，备用；(3)制胶板用琼脂糖溶液与电泳缓冲液混合，其混合体积比为1 0. 7-1. 5，并加 热使其溶解，趁热将胶液倒于大小适宜的玻板上，静置，待凝胶结成无气泡的均勻薄层；(4)电泳在电泳槽内加入电泳缓冲液，将凝胶板置于电泳槽架上，浸入缓冲液； 取步骤(1)准备好的四种样品水溶液，于凝胶板负极端分别点样，立即接通电源，在设定的 电压梯度、电流强度的条件下电泳；(5)染色和脱色取下凝胶板，用染色液染色，再用水洗去多余的染色液至背景无 色为止；(6)结果观察观察样品和标准品所显示的迁移距离。本专利技术进一步改进方案是，步骤(3)、步骤(4)所述的电泳缓冲液为醋酸-锂盐缓 冲液，缓冲液的PH值为2. 0-4. 0。本专利技术更进一步改进方案是，步骤(4)所述的点样，四种样品溶液的点样量分别 为0. 5-1. 5 μ 1。所述的电压梯度为25-35V/cm，电流强度为l-2mA/cm，电泳时间为15-20分 钟。多硫酸软骨素是一种含有葡萄糖醛酸衍生物和乙酰氨基半乳糖衍生物的物质，其 分子结构由2-0-硫酸基-葡萄糖醛酸-(1 — 3) -2-N-乙酰基-2-脱氧-4或6_0_硫酸基 半乳糖组成，而肝素钠没有这样的特殊分子结构。亚硝酸盐或亚硝酸类物质只能降解和硫 酸基连接的氨基粘多糖，而不能降解和乙酰基连接的乙酰氨基半乳糖。因此硝化反应使肝 素钠降解，而多硫酸软骨素不降解或不容易降解，在电泳检测中被检出。通过亚硝酸盐或亚 硝酸之类物质对含有多硫酸软骨素的肝素钠样品进行处理；再通过琼脂糖凝胶电泳检测肝 素钠中的多硫酸软骨素。本专利技术的有益效果一、本专利技术实现了对肝素钠中含量较低的多硫酸软骨素的检测，灵敏度达到0. 5% 以上。二、本专利技术所制备的琼脂糖凝胶厚薄均勻，含水量大(约占98% -99% )，近似自由 电泳，样品扩散性好，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。三、琼脂糖透明无紫外吸收，琼脂糖胶板呈透明状，易于观察，电泳过程和结果可 直接用紫外光灯检测、观察，观察直观，容易判断。四、电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定，且制成干膜可长期保存。五、本专利技术操作简单，电泳速度快。附图说明图1为本专利技术中的四种样品电泳图。图中的1为不含多硫酸软骨素的肝素钠粗品； 图中的2为含有多硫酸软骨素的重量0. 6%的肝素钠粗品；图中的3为肝素钠标准品，图中 的4为多硫酸软骨素标准品。从图示可知，图中的2、4相应位置显现多硫酸软骨素条带，图 中的1、3相应位置未显现该条带。说明本专利技术能检测出肝素钠中含有低于的多硫酸软 骨素(高于此百分比更能检出)。具体实施例以下仅是对本专利技术的说明，而非对本专利技术的限制。(1)样品溶解取不含多硫酸软骨素的肝素钠粗品、含有重量0. 6%多硫酸软骨素 的肝素钠粗品(向不含多硫酸软骨素的肝素钠粗品中加入重量的0.6%多硫酸软骨素得 到)、肝素钠标准品、多硫酸软骨素标准品各200mg，分别溶解于IOml水中。(2)硝化对步骤(1)得到的四种样品溶液，分别加盐酸调PH至2，然后用亚硝酸 钠进行硝化反应1. 5小时，再用氢氧化钠调PH至7，备用；(3)制胶板先配制醋酸-锂盐缓冲液，取冰醋酸50mL，加水SOOmL混合后，用氢氧 化锂调节PH值至3. 0，再加水定溶至IOOOmL ；取琼脂糖0. 2g加入IOmL的水中，置水浴中加热使其完全溶解，向琼脂糖溶液中加入温热的醋酸_锂盐缓冲液10mL (其温度与琼脂糖溶 液温度接近)，混合均勻后，趁热将胶液涂布于(4cmX9cm)的玻板上，厚度约3mm，静置，待 凝胶结成无气泡的均勻薄层，即可；(4)点样与电泳在电泳槽内加入步骤(3)配制的醋酸-锂盐缓冲液，将凝胶板 置于电泳槽架上，经滤纸桥浸入缓冲液；于凝胶板负极端分别用步骤(1)得到的样品溶液 1 U 1点样，立即接通电源，在电压梯度约30V/cm、电流强度l-2mA/cm的条件下，电泳约20 分钟，关闭电源；(5)染色与脱色取下凝胶板，用甲苯胺蓝溶液染色，再用水洗去多余的染色液至 背景无色为止；甲苯胺蓝溶液配制一般可用甲苯胺蓝0. lg溶解于lOOmL水中制得；(6)观察标准样品与对照样品所显示的迁移距离，标准品与对照样品所显示的迁 移距离之比为0. 8-0. 9。权利要求，其特征在于包括下列步骤(1)样品溶解取相同重量的不含多硫酸软骨素的肝素钠粗品、含有重量低于1％多硫酸软骨素的肝素钠粗品、肝素钠标准品、多硫酸软骨素标准品，分别溶解于水中；(2)硝化对步骤(1)得到的四种水溶液，分别加酸调PH至1-3，然后用亚硝酸盐或硝酸盐进行硝化反应0.5-2小时，再用碱调PH至6.5-7.5，备用；(3)制胶板用琼脂糖溶液与电泳缓冲液混合，其混合体积比为1∶0.7-1.5，并加热使其溶解，趁热将胶液倒于大小适宜的玻板上，静置，待凝胶结成无气泡的均匀薄层；(4)电泳在电泳槽内加入电泳缓冲液，将凝胶板置于电泳槽架上，浸入缓冲液；取步骤(1)准备好的四种样品水溶液，于凝胶板负极端分别点样，立即接通电源，在设定的电压梯度、电流强度的条件下电泳；(5)染色和脱色取下凝胶板，用染色液染色，再用水洗去多余的染色液至背景无色为止；(6)结果观察观察样品和标准品所显示的迁移距离。2.如权利要求1所述的，其特征在 于步骤(3)、步骤(4)所述电泳缓冲液为醋酸-锂盐缓冲液，缓冲液的pH值为2. 0-4.0。3.如权本文档来自技高网...

【技术保护点】
肝素钠中多硫酸软骨素的琼脂糖凝胶电泳检测方法，其特征在于包括下列步骤：（１）样品溶解：取相同重量的不含多硫酸软骨素的肝素钠粗品、含有重量低于１％多硫酸软骨素的肝素钠粗品、肝素钠标准品、多硫酸软骨素标准品，分别溶解于水中；（２）硝化：对步骤（１）得到的四种水溶液，分别加酸调ＰＨ至１－３，然后用亚硝酸盐或硝酸盐进行硝化反应０．５－２小时，再用碱调ＰＨ至６．５－７．５，备用；（３）制胶板：用琼脂糖溶液与电泳缓冲液混合，其混合体积比为１∶０．７－１．５，并加热使其溶解，趁热将胶液倒于大小适宜的玻板上，静置，待凝胶结成无气泡的均匀薄层；（４）电泳：在电泳槽内加入电泳缓冲液，将凝胶板置于电泳槽架上，浸入缓冲液；取步骤（１）准备好的四种样品水溶液，于凝胶板负极端分别点样，立即接通电源，在设定的电压梯度、电流强度的条件下电泳；（５）染色和脱色：取下凝胶板，用染色液染色，再用水洗去多余的染色液至背景无色为止；（６）结果观察：观察样品和标准品所显示的迁移距离。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘榜惠，张志斌，袁红英，
申请(专利权)人：淮安麦德森化学有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]