一种基于磁性树脂的核酸提取方法技术

本申请提供一种基于磁性树脂的核酸提取方法，属于生物技术领域。本申请通过在核酸提取过程中增加磁性树脂吸附处理步骤，可有效分离土壤、粪便等复杂样本中的杂质，得到高纯度的DNA产物，有利于下游体系的应用。有利于下游体系的应用。有利于下游体系的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种基于磁性树脂的核酸提取方法


[0001]本申请涉及生物
，具体涉及一种基于磁性树脂的核酸提取方法。

技术介绍

[0002]借助于二代测序技术进行微生物基因组学的分析已成为微生物多样性分析的主要技术手段。对土壤、水体及粪便等样本的微生物的核酸变异和数量分析能够反映菌群中各类微生物的种类和丰度，解码菌群物种分布的特征及差异。然而土壤、水体及粪便等样本含有过多的杂质(如腐殖质，腐殖酸、黄腐酸等)，在核酸提取过程中，该类杂质通常会与核酸结合并残留到提取的核酸产物中，对下游的PCR或qPCR具有显著的抑制。因此从土壤、水体及粪便等样本中提取核酸时，杂质的干扰成为制约核酸提取质量的重要限制性因素。
[0003]针对土壤及粪便核酸提取，目前市面上的产品大多通过沉淀法去除杂质。如US7459548B2公布了一种利用乙酸铵作为第一絮凝剂，使用硫酸铝铵或十二水硫酸铝铵作为第二絮凝剂从样本中的沉淀杂质，从而提升核酸提取纯度。CN113045684A公布了一种乙二胺四乙酸酐和葡聚糖酯化接枝制备得到的沉淀剂能除去生物样本中的金属离子，提升土壤样本核酸的活性。但这些杂质去除的方式都是通过离心沉淀的方式去除，操作比较繁琐，不易实现自动化处理。同时在核酸提取上提取时间长，容易造成核酸降解，影响下游的核酸检测准确度。

技术实现思路

[0004]本申请的目的在于提供一种基于磁性树脂的核酸提取方法。本申请的方法使用磁性阴离子交换树脂吸附土壤和粪便样本中的杂质，并通过磁场使结合了杂质的磁性阴离子树脂与样本分离，简化了传统沉淀剂离心的方式去除杂质的流程，缩短了核酸提取时间。使用本申请所述方法提取得到的土壤、粪便样本核酸纯度显著提高，有利于下游应用。
[0005]本申请的第一方面提供一种基于磁性树脂的核酸提取方法，所述方法包括如下步骤：
[0006](1)收集生物样本或环境样本，加入裂解液，释放核酸；
[0007](2)加入磁性树脂吸附，磁性分离弃去磁性树脂及其吸附物，保留液体；
[0008](3)使用固相载体吸附所述液体中的核酸；
[0009](4)清洗已吸附核酸的固相载体；
[0010](5)洗脱，获得提取后的核酸产物。
[0011]在一些实施方案中，所述生物样本是粪便样本。
[0012]在一些实施方案中，所述环境样本是土壤样本或水体样本。
[0013]在一些实施方案中，所述裂解液包含离液剂、缓冲盐和表面活性剂。所述离液剂是例如胍盐、尿素和高氯酸锂中的一种或多种，优选胍盐，更优选盐酸胍和/或异硫氰酸胍；所述缓冲盐是磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐和Tris中的一种或多种，优选磷酸盐，更优选NaH2PO3和Na2HPO4中的一种或两种；所述表面活性剂是例如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、
两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂中的一种或多种，优选非离子表面活性剂，更优选吐温20和/或癸基糖苷。
[0014]在一些实施方案中，所述步骤(1)还包括使用机械裂解法，例如使用玻璃珠，例如在样本中加入玻璃珠涡旋震荡。
[0015]在一些实施方案中，所述步骤(1)还包括在加入裂解液后离心，相对离心力为8000
‑
20000
×
g，优选8000
‑
18000
×
g，包括所述范围内的8000
×
g、8500
×
g、9000
×
g、9500
×
g、10000
×
g、11000
×
g、12000
×
g、13000
×
g、14000
×
g、15000
×
g、16000
×
g、17000
×
g和18000
×
g。
[0016]在一些实施方案中，每克粪便样本使用约0.1
‑
5g磁性树脂，优选约0.5
‑
3g磁性树脂，更优选约0.5
‑
2.5g磁性树脂，包括所述范围内的0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g、1g、1.1g、1.2g、1.3g、1.4g、1.5g、1.6g、1.7g、1.8g、1.9g、2g、2.1g、2.2g、2.3g、2.4g和2.5g。
[0017]在一些实施方案中，每克土壤样本使用约0.1
‑
5g磁性树脂，优选约0.2
‑
3g磁性树脂，更优选约0.3
‑
2g磁性树脂，包括所述范围内的0.3g、0.4、0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g、1g、1.1g、1.2g、1.3g、1.4g、1.5g、1.6g、1.7g、1.8g、1.9g和2g。
[0018]在一些实施方案中，所述步骤(2)包括加入一种或多种磁性树脂。
[0019]在一些实施方案中，所述磁性树脂是磁性阴离子交换树脂，所述磁性阴离子树脂是碱性，如强碱性或弱碱性磁性树脂。
[0020]在一些实施方案中，所述磁性树脂的基体(骨架)种类是苯乙烯系、丙烯酸系、醋酸系、环氧系、乙烯吡啶系、脲醛系或氯乙烯系中的一种。
[0021]在一些实施方案中，所述磁性树脂的孔隙结构是凝胶型或大孔型，优选大孔型。
[0022]在一些实施方案中，所述磁性树脂的磁核材料是铁氧化合物，如γ
‑
Fe2O3或Fe3O4。
[0023]在一些实施方案中，所述磁性树脂是γ
‑
Fe2O3磁性大孔碱性丙烯酸系阴离子交换树脂或Fe3O4磁性大孔碱性丙烯酸系阴离子交换树脂，如γ
‑
Fe2O3磁性大孔强碱性丙烯酸系阴离子交换树脂，或γ
‑
Fe2O3磁性大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂，或Fe3O4磁性大孔强碱性丙烯酸系阴离子交换树脂，或Fe3O4磁性大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂。
[0024]在一些实施方案中，所述磁性树脂是MIEX、NDMP
‑
1或ND100。
[0025]在一些实施方案中，所述磁性树脂结合样本中的非核酸杂质。
[0026]在一些实施方案中，所述非核酸杂质是指抑制PCR过程的杂质，如抑制DNA聚合酶活性的杂质。
[0027]在一些实施方案中，所述固相载体是磁性吸附介质，优选磁性颗粒，更优选磁珠。
[0028]在一些实施方案中，所述固相载体是硅基质吸附介质，例如硅珠，硅基质膜。
[0029]在一些实施方案中，所述固相载体是阴离子交换材料，如阴离子交换柱。
[0030]在一些实施方案中，当所述固相载体是磁珠时，所述步骤(3)还包括加入裂解结合液。
[0031]在一些实施方案中，所述裂解结合液包含离液剂、缓冲盐、金属螯合剂、醇和表面活性剂；所述离液剂是例如胍盐、尿素和高氯酸锂中的一种或多种，优选胍盐，更优选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于磁性树脂的核酸提取方法，所述方法包括如下步骤：(1)收集生物样本或环境样本，加入裂解液，释放核酸；(2)加入磁性树脂吸附，磁性分离弃去磁性树脂及其吸附物，保留液体；(3)使用固相载体吸附所述液体中的核酸；(4)清洗已吸附核酸的固相载体；(5)洗脱获得核酸产物。2.一种基于磁性树脂的核酸提取方法，所述方法包括如下步骤：(1)收集生物样本或环境样本，加入稀释液，释放或分散样本中的微生物；(2)加入磁性树脂吸附，磁性分离弃去磁性树脂及其吸附物，保留液体；(3)对所述液体进行裂解，释放核酸；(4)使用固相载体吸附所述液体中的核酸；(5)清洗已吸附核酸的固相载体；(6)洗脱获得核酸产物。3.一种基于磁性树脂的核酸提取方法，所述方法包括如下步骤：(1)收集生物样本或环境样本，加入裂解液，释放核酸；(2)加入磁性树脂吸附，磁性分离弃去磁性树脂及其吸附物，保留液体；(3)加入酚
‑
氯仿溶液，混匀后，离心取上清液；(4)向上清液中加入异丙醇和/或乙醇，离心分离获得DNA沉淀；(5)洗涤DNA沉淀，用水或TE缓冲液溶解，获得DNA产物。4.一种基于磁性树脂的核酸提取方法，所述方法包括如下步骤：(1)收集生物样本或环境样本，加入裂解液，释放核酸；(2)加入磁性树脂吸附，磁性分离弃去磁性树脂及其吸附物，保留液体；(3)加入饱和NaCl溶液或包含5
‑
6M NaCl的溶液，混匀后，离心取上清，(4)向上清液中加入异丙醇和/或乙醇，离心分离获得DNA沉淀；(5)洗涤DNA沉淀，用水或TE缓冲液溶解，获得DNA产物。5.一种基于磁性树脂的核酸提取方法，所述方法包括如下步骤：(1)收集生物样本或环境样本，加入稀释液，释放或分散样本中的微生物；(2)加入磁性树脂吸附，磁性分离弃去磁性树脂及其吸附物，保留液体；(3)对所述液体进行裂解，释放核酸；(4)加入酚
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氯仿溶液，混匀后，离心取上清液；(5)向上清液中加入异丙醇和/或乙醇，离心分离获得DNA沉淀；(6)洗涤DNA沉淀，用水或TE缓冲液溶解，获得DNA产物。6.一种基于磁性树脂的核酸提取方法，所述方法包括如下步骤：(1)收集生物样本或环境样本，加入稀释液，释放或分散样本中的微生物；(2)加入磁性树脂吸附，磁性分离弃去磁性树脂及其吸附物，保留液体；(3)对所述液体进行裂解，释放核酸；(4)加入饱和NaCl溶液或包含5
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6M NaCl的溶液，混匀后，离心取上清；(5)向上清液中加入异丙醇和/或乙醇，离心分离获得DNA沉淀；(6)洗涤DNA沉淀，用水或TE缓冲液溶解，获得DNA产物。
7.权利要求1
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6任一项所述的方法，所述生物样本是粪便样本，所述环境样本是土壤样本或水体样本。8.权利要求1
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6任一项所述的方法，所述磁性树脂是磁性阴离子交换树脂；优选地，所述磁性树脂是磁性丙烯酸系阴离子交换树脂；优选地，所述磁性树脂是磁性大孔碱性丙烯酸系阴离子交换树脂；优选地，所述磁性树脂是Fe3O4磁性大孔碱性丙烯酸系阴离子交换树脂或所述磁性树脂是γ
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Fe2O3磁性大孔碱性丙烯酸系阴离子...

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿志鹏，聂俊伟，张力军，王丹凤，
申请(专利权)人：南京液滴逻辑生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：