一种可与磁珠结合进行病毒核酸提取的裂解液制造技术

一种可与磁珠结合进行病毒核酸提取的裂解液本发明专利技术涉及一种可与磁珠结合进行病毒核酸提取的裂解液，病毒在裂解液的作用下释放核酸并吸附在磁珠上，吸附在磁珠上的核酸及洗脱下的核酸溶液均可直接进行下游的扩增、检测、分子杂交等实验，此外该病毒裂解液可直接使用全血进行病毒核酸裂解，可适用于畜牧类传染性疾病的快速现场检测。疾病的快速现场检测。

【技术实现步骤摘要】
一种可与磁珠结合进行病毒核酸提取的裂解液


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种可与磁珠法结合的病毒核酸裂解液。

技术介绍

[0002]在面对这种传播能力强危害大的传染病时，快速的病情诊断和有效的隔离变成了疫情控制的关键点，因此需要进行大规模的核酸检测，而进行核酸检测时需要进行核酸提取，实验室常用的核酸提取方法是使用试剂盒进行纯度要求高的核酸提取和煮沸法进行核酸的粗提取，但常用的磁珠法核酸提取试剂盒中的病毒核酸裂解液进行病毒裂解前需要对样本进行处理，需要在裂解前将多种试剂进行混合，病毒裂解时间长，总核酸提取时间长，在核酸提取过程中有大量的离心操作；而煮沸法进行病毒裂解所获得核酸杂质多，会对下游实验产生干扰且在加热过程中核酸链容易断裂，适合于一些要求不高得实验，以上方法均无法应用于大型自动化核酸提取检测仪器;因此，面对重大疫情爆发的境况，开发一种无需进行样本处理，裂解时间短，操作简单，可与磁珠法结合，无离心操作，可实现痕量病毒核酸裂解，提取核酸纯度高，灵敏度高及可应用于大型核酸提取检测仪器的病毒核酸裂解液和核酸提取方法成了一个大问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术为提高病毒核酸提取速度，降低提取核酸提取操作的复杂性，从病毒核酸裂解液入手，直接使用未处理的全血进行病毒核酸提取，此外还将全血病毒核酸裂解与磁珠法核酸提取相结合，裂解液释放的核酸可与磁珠相结合，实现全血中核酸的富集，磁珠吸附核酸经过洗涤和洗脱获得的病毒核酸溶液可直接用于下游的PCR扩增，环介导等温扩增（LAMP）,分子杂交等，此外，磁珠吸附核酸后，无需将核酸洗脱，带核酸的磁珠可直接加环介导等温扩增（LAMP）,实现一管式核酸提取扩增，加速病毒检测。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采取如下技术方案：本专利技术提供一种可与磁珠结合进行病毒核酸提取的裂解液，具体包括以下步骤：步骤1：配置病毒核酸裂解液：A液：50mM Tris
‑
HCl、1M NaCl、10mM EDTA、质量/体积比为5%的十二烷基硫酸锂（LDS），称量好相应试剂并在55℃水浴条件下加热促进试剂融化，调整溶液pH至5~5.5；B液：20mg/mL蛋白酶K溶液；步骤2：取100μL的全血，加入1.5mL Ep管中，加入 150μL A液和20μL B液，涡旋混匀，在63℃水浴条件下，反应30min；步骤3：向反应完的混合溶液中加入250μL异丙醇用于沉降核酸，静置1min；步骤4：再向混合溶液中加入10μL涡旋混合均匀的100mg/mL羟基二氧化硅磁珠，震荡混匀后，静置2min，使磁珠和裂解出的核酸充分结合；步骤5：使用磁铁固定磁珠，分离混合物中含有杂质的上清液；步骤6：加入200μL的70%乙醇溶液，快速吹打混匀，将所有的混合物转移到新的
1.5mL Ep管中，以避免原管壁上黏附的血液杂质对扩增及检测产生影响；步骤7：使用磁铁固定磁珠，分离中含有杂质上清液；步骤8：加入200μL的70%乙醇溶液，再次快速吹打混匀；步骤9：使用磁铁固定磁珠，分离中含有杂质上清液；步骤10：加入200μL的70%乙醇溶液，再次快速吹打混匀，进行磁珠和管壁的再次清洗；步骤11：使用磁铁固定磁珠，再次分离含有杂质上清液，随后加入50μL的TE缓冲液（pH 8.0），轻轻吹打混匀，在55℃水浴条件下进行核酸洗脱，10min后，使用磁铁固定磁珠，将含核酸的上清液转移到新的Ep管进行保存，也可直接以此为模板进行PCR扩增，LAMP扩增和分子杂交等实验。
[0005]本专利技术方法具有如下优点：采用本专利技术的病毒裂解液具有可实现全血中病毒的裂解、无需进行样本前期处理、裂解时间短、无需大型仪器、无需离心操作、对操作人员要求极低、可实现痕量病毒核酸裂解、可与磁珠法结合、提取核酸纯度高、灵敏度高及可应用于大型核酸提取检测仪器的优点；相比于市面上的裂解液，本专利技术具有成本低，反应时间短，提取过程中无离心操作对操作人员技术要求低及可应用于大型核酸提取检测仪器的优点；相比于煮沸法核酸提取，本专利技术提取的核酸纯度高，磁珠上洗脱下来的核酸可以直接进行PCR扩增，环介导等温扩增（LAMP）等下游操作且灵敏度和准确率高，特别适用于重大疾病的床边诊断和爆发重大疫情的大规模的现场检验工作。
附图说明
[0006]图1所示为利用本专利技术的病毒核酸裂解液和磁珠结合进行全血中非洲猪瘟病毒核酸提取，以提取后所获核酸溶液为模板，进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图，其中1泳道为Marker、2泳道为含非洲猪瘟病毒核酸的阳性对照、3泳道为不含非洲猪瘟病毒核酸的阴性对照图2所示为利用本专利技术的病毒核酸裂解液和磁珠结合进行全血中非洲猪瘟病毒核酸提取，以提取后所获核酸溶液为模板进行LAMP扩增的琼脂糖凝胶电泳图，其中1泳道为Marker、2泳道为含非洲猪瘟病毒核酸的阳性对照、3泳道为不含非洲猪瘟病毒核酸的阴性对照图3所示为利用本专利技术的病毒核酸裂解液和磁珠结合进行全血中非洲猪瘟病毒核酸提取，以吸附核酸的磁珠为模板进行钙黄绿素的显色图，其中含非洲猪瘟病毒核酸的阳性对照1、含非洲猪瘟病毒核酸的阳性对照2，为带有非洲猪瘟病毒的血样的显色实验结果，阴性为不含非洲猪瘟病毒核酸阴性对照的显色实验结果，空白为将DEPC水作为模板进行的扩增结果。
具体实施方式
[0007]以下结合实例对本专利技术作进一步说明，以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0008]实施例1以患非洲猪瘟的家猪全血作为样本进行实验。
步骤1：配置病毒核酸裂解液，A液：取50mL 1M Tris
‑
HCl（pH=8.0）、称取58.44g 的NaCl、称取2.9224g的EDTA、称取50g十二烷基硫酸锂（LDS），称量好相应试剂溶解在900mL无菌水中，调整pH至5~5.5并定容到1000mL。混合好的A液在55℃水浴条件下加热促进所加试剂溶解； B液：20mg/mL 蛋白酶K溶液；步骤2：取100μL的全血，加入1.5mL Ep管中，加入 150μL A液和20μL B液，涡旋混匀，在63℃水浴条件下，反应30min；步骤3：向反应完的混合溶液中加入250μL异丙醇用于沉降核酸，静置1min；步骤4：再向混合溶液中加入10μL涡旋混匀的100mg/mL羟基二氧化硅磁珠，震荡混匀后，静置2min，使磁珠和裂解出的核酸充分结合；步骤5：使用磁铁固定磁珠，分离混合物中含有杂质的上清液；步骤6：加入200μL的70%乙醇溶液，快速吹打混匀，将所有的混合物转移到新的1.5mL Ep管中，以避免原管壁上黏附的血液杂质对扩增及检测产生影响；步骤7：使用磁铁固定磁珠，分离中含有杂质上清液；步骤8：加入200μL的70%乙醇溶液，再次快速吹打混匀；步骤9：使用磁铁固定磁珠，分离中含有杂质上清液；步骤10：加入200μL的70%乙醇溶液，再次快速吹打混匀，进行磁珠和管壁的再次清洗；步骤11：使用磁铁固定磁珠，再次分离混合物中上清液分离中含有杂质上清液，随后加入50μL的TE缓冲液（pH 8.0），轻轻吹打混匀，在55℃水浴条件本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.本发明所用病毒裂解液，由其特征在于由A液：50mM Tris
‑
HCl、1M NaCl、10mM EDTA、质量/体积比为5%的十二烷基硫酸锂（LDS）和B液：浓度为20mg/mL蛋白酶K组成，该裂解液的pH在5~5.5，B液在裂解时加入。2.一种如权利要求1所述的可与磁珠结合进行病毒核酸提取的裂解液，其特征在于裂解液使全血中病毒裂解释放核酸后，核酸与羟基二氧化硅磁珠结合，实现游离...

【专利技术属性】
技术研发人员：王庆伟，阳秀芬，宋凤阁，万逸，周永灿，孙云，蔡慧莹，陶钰玲，林心怡，申逸，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：