一种结合猴痘病毒表面包膜蛋白的核酸适体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种结合猴痘病毒表面包膜蛋白的核酸适体及其应用，属于生物技术领域，包括，核酸适体HIM

【技术实现步骤摘要】
一种结合猴痘病毒表面包膜蛋白的核酸适体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种结合猴痘病毒表面包膜蛋白的核酸适体及其应用。

技术介绍

[0002]猴痘病毒是1958年初次在猴子身上发现的一种DNA病毒，其感染症状和天花类似。但猴痘病毒的宿主不仅仅是猴，也包括啮齿类动物，甚至是其他动物包括人类。最新数据显示，目前已有多达三十几个国家发现了猴痘病毒感染案例，死亡人数也在逐渐增加，猴痘病毒全球爆发风险急剧增加，故亟需研发猴痘病毒的高效诊断方法。
[0003]核酸适体（aptamer）是指通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选分离得到的对靶标具有高特异性、高亲和力的单链DNA或者RNA分子。核酸适体的靶标非常广泛包括蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞等，在生化分析、环境监测、基础学、新药合成等研究领域有广阔的前景。核酸适体在变复性后可以折叠形成多种多样的二级结构，如茎环结构、发夹结构等与靶标的部分空间结构形成互补，然后在疏水作用、氢键、静电作用及范德华力等分子间作用力下与靶标特异性结合。核酸适体与抗体有很多共性，比如都可以特异性识别并结合某种蛋白，对其靶标都有很好的亲和力和较高的特异性，但核酸适体在很多方面比抗体更有优势，主要体现为以下几点：（1）核酸适体更容易合成与化学修饰，可以通过固相合成法人工化学合成，批间差异小，合成的成本低，合成时可以修饰某些化学基团，增强其稳定性并可以方便后续偶联药物等。相比之下，抗体的合成需要准备抗原、选择免疫动物、细胞融合并扩大培养等等，后续还需要一系列的纯化步骤，整个流程是非常复杂而且费时的，而且不同批次合成的抗体之间会有些差异；（2）核酸适体的稳定性更好，保存只需放在
‑
20度冰箱即可，而且保存时间长。而抗体的保存条件就比较严苛，且放几个月后抗体活性就会降低，影响其使用；（3）核酸适体的免疫原性比抗体低；（4）核酸适体的靶标范围更加广泛，从各种小分子、金属离子、多肽或者蛋白、核酸以及细胞等等都可以作为筛选的靶标，抗体的靶标大多为蛋白质。
[0004]体外指数富集的配体系统进化（SELEX）技术，其基本原理是利用寡核苷酸文库与靶分子间的相互作用，从事先构建好的随机单链寡核苷酸库中筛选出并分离出可特异结合靶分子的核酸序列，再利用聚合酶链式反应（PCR）体外扩增技术，使文库中具有特异性的序列得到指数富集。因此，筛选具有一种结合猴痘病毒表面包膜蛋白的核酸适体，对其诊断及治疗具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的结合猴痘病毒表面包膜蛋白的核酸适体，可用于负载并靶向递送治疗猴痘病毒肺炎的药物，可作为猴痘病毒的显影剂或示踪剂，用于制备检测猴痘所使用的试剂和/或试纸和/或试剂盒。
[0006]本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：一种结合猴痘病毒表面包膜蛋白的核酸适体，包括，如下（1）
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（6）中的至少一种：（1）如 SEQ ID No.1所示的核酸适体HIM
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A29
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1；（2）如 SEQ ID No.2所示的核酸适体HIM
‑
A29
‑
2；（3）如 SEQ ID No.3所示的核酸适体HIM
‑
A29
‑
3；（4）如 SEQ ID No.4所示的核酸适体HIM
‑
A29
‑
4；（5）如 SEQ ID No.5所示的核酸适体HIM
‑
A29
‑
5；（6）如 SEQ ID No.6所示的核酸适体HIM
‑
A29
‑
6。
[0007]本专利技术核酸适体具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的优点。本专利技术核酸适体可用于负载并靶向递送治疗猴痘病毒肺炎的药物，以及作为猴痘病毒的显影剂或示踪剂，制备检测猴痘所使用的试剂和/或试纸和/或试剂盒。
[0008]在该核酸适体中，核酸适体的亲和力KD值＜40nM。优选地，核酸适体的亲和力KD值＜20nM。进一步优选地，核酸适体的亲和力KD值＜10nM。
[0009]本专利技术还提供了一种用于筛选上述核酸适体的组合物，包括，
‑
固相支持物，固相支持物包括磁珠和/或琼脂糖凝胶珠；和
‑
与固相支持物结合的目标分子或目标分子的一部分，目标分子为猴痘病毒表面包膜蛋白A29和/或DNA。
[0010]本专利技术组合物能够提高筛选效率，仅需要7轮筛选即可获得高亲和力的核酸适体。
[0011]本专利技术组合物中，磁珠和琼脂糖凝胶珠均能够直接、高效、快速地连接目标分子。
[0012]在该组合物中，磁珠包含羧基修饰磁珠和/或组蛋白修饰磁珠。
[0013]在该组合物中，琼脂糖凝胶珠包含链霉亲和素修饰琼脂糖凝胶珠。
[0014]本专利技术还公开了上述组合物的制备方法，包括如下步骤：取羧基磁珠，活化表面羧基后，加入猴痘病毒表面包膜蛋白A29进行孵育；孵育后封闭磁珠表面未反应的位点，洗涤即得组合物；或者，取琼脂糖凝胶珠，加入猴痘病毒表面包膜蛋白A29进行孵育，孵育后洗涤即得组合物。
[0015]在该制备方法中，使用N
‑
羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）进行羧基的活化。
[0016]本专利技术还提供了一种用于筛选上述核酸适体的反应体系，包括，
‑
单链DNA文库，单链DNA文库包括至少一条能够特异性识别目标分子或目标分子的一部分的核苷酸链，目标分子为猴痘病毒表面包膜蛋白A29和/或DNA；
‑
引物，引物的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
‑
权利要求2的组合物；
‑
缓冲液。
[0017]在该反应体系中，随机单链DNA文库的序列如SEQ ID NO.9所示。
[0018]在该反应体系中，缓冲液包括DPBS缓冲液。
[0019]本专利技术还提供了一种筛选上述核酸适体的方法，包括如下步骤：
‑
合成单链DNA文库和引物；
‑
磁珠法和/或琼脂糖凝胶珠法筛选，包括配制权利要求3的反应体系、正筛和反
筛、PCR扩增和制备单链。
[0020]在该方法中，配制用于筛选核酸适体的反应体系，包括制备用于筛选核酸适体的组合物。
[0021]优选地，制备用于筛选核酸适体的组合物的方法，包括如下步骤：取羧基磁珠，活化表面羧基后，加入猴痘病毒表面包膜蛋白A29进行孵育；孵育后封闭磁珠表面未反应的位点，洗涤即得组合物；或者，取琼脂糖凝胶珠，加入猴痘病毒表面包膜蛋白A29进行孵育，孵育后洗涤即得组合物。
[0022]更优选地，使用N
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结合猴痘病毒表面包膜蛋白的核酸适体，包括，如下（1）
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（6）中的至少一种：（1）如 SEQ ID No.1所示的核酸适体HIM
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A29
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1；（2）如 SEQ ID No.2所示的核酸适体HIM
‑
A29
‑
2；（3）如 SEQ ID No.3所示的核酸适体HIM
‑
A29
‑
3；（4）如 SEQ ID No.4所示的核酸适体HIM
‑
A29
‑
4；（5）如 SEQ ID No.5所示的核酸适体HIM
‑
A29
‑
5；（6）如 SEQ ID No.6所示的核酸适体HIM
‑
A29
‑
6。2. 一种用于筛选权利要求1所述核酸适体的组合物，包括，
‑
固相支持物，所述固相支持物包括磁珠和/或琼脂糖凝胶珠；和
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与所述固相支持物结合的目标分子或目标分子的一部分，所述目标分子为猴痘病毒表面包膜蛋白A29和/或DNA。3.一种用于筛选权利要求1所述核酸适体的反应体系，包括，
‑
单链DNA文库，所述单链DNA文库包括至少一条能够特异性识别所述目标分子或目标分子的一部分的核苷酸链，所述目标分子为猴痘病毒表面包膜蛋白A29和/或DNA；
‑
引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭蔚泓，何嘉轩，付晓艺，宋明慧，张峥，罗昭锋，渠凤丽，符婷，林艺志，尤其敏，
申请(专利权)人：中国科学院基础医学与肿瘤研究所筹，
类型：发明
国别省市：