一种含钙的壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种含钙的壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用，方法具体包括：将27.75

【技术实现步骤摘要】
一种含钙的壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医学材料
，具体涉及一种含钙的壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]壳聚糖是一种具有保健作用的纤维素，存在于甲壳类的动物或者是肢节昆虫的体内。壳聚糖可作为减脂的膳食补充剂。有报道称壳聚糖有比较好的控制血脂的作用，特别是对于降低胆固醇很有好处。可以防止食物中的脂肪的吸收，也可以加速人体血液中的胆固醇代谢。然而，目前壳聚糖的减脂的相关报道仅与细胞外脂质的去除有关，并且临床试验中降脂效果并不明显。其潜在的降脂功能仍不明确，机制尚待阐明。主要原因是现有的壳聚糖减脂的配方减脂效果不明确。因此，为解决上述问题，本专利设计了一种新型的壳聚糖凝胶，改变了壳聚糖分子的组装状态，并加入能够促进壳聚糖与脂质的结合和促进脂质降解的碳酸钙。
[0003]此外，肿瘤细胞最重要的代谢特征之一是脂质代谢的失调和脂质的大量集聚。癌症在发展的过程中需要大量的脂肪酸。癌症细胞利用新生脂肪生成和脂肪酸摄取，驱动的脂肪酶过度表达介导脂质积累，进一步支持肿瘤的快速增殖、存活、迁移、转移和化疗耐药。脂滴是是肿瘤细胞储存多余脂质和减少细胞脂质应激的主要细胞器，主要由磷脂单层包围的中性脂质组成。肿瘤细胞脂质的过度积累会暂时以脂滴的形式储存起来，而脂滴的形成是对有害环境的关键适应性反应。脂滴参与肿瘤发生和肿瘤进展的各个方面，因此靶向脂滴与肿瘤脂质代谢是一种很有前途的治疗人类癌症的策略。
[0004]随着水凝胶技术的发展，水凝胶作为新兴的药物载体已广泛用于生物医学领域。水凝胶所具备的生物相容性、生物降解性、载药能力和可控的药物释放使其在肿瘤治疗领域极具竞争力。壳聚糖水凝胶，具有良好的组织相容性和生物可降解性。
[0005]我们利用壳聚糖的脂质结合特性，设计一种碳酸钙纳米颗粒交联的壳聚糖低聚物水凝胶配方。其中壳聚糖能够进入细胞内，在细胞内破坏脂滴，碳酸钙能够加速壳聚糖的溶酶体逃逸，生成的钙离子有助于加速线粒体中的脂肪酸氧化，促进脂质降解为脂肪酸，因此该配方具有很强的去除细胞内脂质的功能。而在肿瘤微环境中，复合壳聚糖水凝胶首先剥夺肿瘤细胞内的脂质，降低肿瘤内的脂肪含量。在此基础上形成细胞外壳聚糖
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脂质复合物，促进免疫细胞进入，通过激活巨噬细胞，逆转免疫抑制微环境。单独在肿瘤中使用复合壳聚糖凝胶或者将壳聚糖凝胶与免疫检查点抑制剂和化疗药物联用，均能起到提高肿瘤免疫治疗的效果，可应用于肿瘤治疗。总之，本专利技术设计了一种碳酸钙交联的壳聚糖水凝胶，并将其用于降低细胞内脂质、降低组织内脂质、和肿瘤免疫治疗的增敏剂。该水凝胶具有明确的脂质降解机制，即通过诱导脂滴的自噬实现细胞内脂滴的减少，与壳聚糖溶液相比，该水凝胶对细胞内脂滴的去除效果具有显著性，显著提升了现有壳聚糖溶液和相关制剂的脂质去除效果。同时，也能够作为一种佐剂，通过刺激巨噬细胞的抗原识别受体的调控，提高疫苗的抗原提呈效果，实现高效免疫。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提出一种含钙的壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用，通过pH调节与温度调节，制备壳聚糖水凝胶。一方面，壳聚糖水凝胶进入细胞，在逃离溶酶体并分解成小而均匀的纳米颗粒后，在细胞内与脂滴结合并导致脂滴分解，通过将脂滴与LC3结合而导致脂噬，由于过度活性的脂肪酸氧化，壳聚糖水凝胶诱导的脂滴降解增强了肿瘤细胞的免疫原性。另一方面，壳聚糖水凝胶剥夺了细胞脂质，形成了细胞外壳聚糖
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脂质复合物，提高了肿瘤浸润淋巴细胞中的Mincle，逆转了免疫抑制微环境。综上，本专利技术的含钙的壳聚糖水凝胶可达到去除胞内脂质和在肿瘤免疫治疗中增敏的目的。
[0007]一种含钙的壳聚糖水凝胶制备方法，该方法包括如下步骤：
[0008]步骤一：将27.75
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111mg/mL的氯化钙溶液与50
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200mg/mL、聚天冬氨酸钠为分子量为4000
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8000Da的聚天冬氨酸钠溶液等体积混合，搅拌至均匀，往混合溶液中滴加21
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84mg/mL的碳酸氢钠溶液，室温下搅拌5
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15分钟，得到碳酸钙纳米颗粒悬液；
[0009]步骤二：将300～450μL碳酸钙纳米颗粒悬液加到800μL的15
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45mg/mL、脱乙酰度大于80％的壳聚糖溶液中，搅拌至澄清，测试溶液的pH值，若未在6.7～7.4范围内，则添加碳酸氢钠溶液，使溶液的pH值在6.7～7.4范围内；再在37℃水浴5
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15分钟，得到含钙的壳聚糖水凝胶。
[0010]调节溶液的pH值达到6.7～7.4，目的是为了降低静电斥力，增强
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NH2基团之间的氢键和疏水相互作用。
[0011]进一步地，步骤一中，氯化钙溶液的浓度为111mg/mL，聚天冬氨酸钠的分子量为8000Da，聚天冬氨酸钠溶液的浓度为200mg/mL，碳酸氢钠溶液的浓度为84mg/mL；步骤二中，碳酸钙纳米颗粒悬液的体积为300μL，壳聚糖溶液的浓度为25mg/mL。
[0012]进一步地，所述搅拌为磁力搅拌。
[0013]一种上述方法制备得到的含钙的壳聚糖水凝胶。
[0014]一种由上述方法制备得到的含钙的壳聚糖水凝胶在去除胞内脂质中的应用。
[0015]一种由上述方法制备得到的含钙的壳聚糖水凝胶在肿瘤治疗增敏中的应用。
[0016]本专利技术的有益效果如下：
[0017](1)与单纯的壳聚糖溶液相比，凝胶态壳聚糖在进入细胞后，会形成小而均匀的纳米颗粒，与脂滴结合并破坏脂滴，通过LC3和脂滴结合导致脂噬，在钙离子的协同作用下，凝胶态的壳聚糖表现出更强的去除胞内脂质的效果。
[0018](2)脂滴被破坏后，游离的脂肪酸被转运到线粒体，脂肪酸氧化被激活，因此含钙的壳聚糖水凝胶诱导调节了肿瘤细胞的脂质代谢并增强了肿瘤细胞的免疫原性。
[0019](3)含钙的壳聚糖水凝胶处理的免疫细胞表现出脂肪酸氧化的降低和免疫激活。含钙的壳聚糖水凝胶上调了巨噬细胞上的脂质感应c型凝集素受体Mincle，这导致了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用显著上升和高效的抗原呈递。
[0020](4)当与aPD
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L1和吉西他滨联合治疗时，含钙的壳聚糖水凝胶在瘤内治疗时可显著减缓肿瘤生长速率并提高荷瘤小鼠的生存率，这表明含钙的壳聚糖水凝胶有能力使癌症细胞对治疗敏感。
附图说明
[0021]图1为含钙的壳聚糖水凝胶的共定位表征和其对细胞活性的影响；其中，图(A)为含钙壳聚糖凝胶的共定位荧光共聚焦图，图(A)的左图为碳酸钙纳米颗粒，中图为壳聚糖，右图为碳酸钙纳米颗粒和壳聚糖的合并图；图(B)为含钙壳聚糖凝胶的冻干SEM图；图(C)为壳聚糖凝胶与含钙的壳聚糖凝胶对肿瘤细胞增值影响的结果分析图；图(D)为不同浓度的含钙壳聚糖与免疫细胞RAW 264.7细胞进行共培养后CCK
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8实验结果本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含钙的壳聚糖水凝胶制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤一：将27.75
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111mg/mL的氯化钙溶液与50
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200mg/mL、聚天冬氨酸钠为分子量为4000
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8000Da的聚天冬氨酸钠溶液等体积混合，搅拌至均匀，往混合溶液中滴加21
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84mg/mL的碳酸氢钠溶液，室温下搅拌5
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15分钟，得到碳酸钙纳米颗粒悬液；步骤二：将300～450μL碳酸钙纳米颗粒悬液加到800μL的15
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45mg/mL、脱乙酰度大于80％的壳聚糖溶液中，搅拌至澄清，测试溶液的pH值，若未在6.7～7.4范围内，则添加碳酸氢钠溶液，使溶液的pH值在6.7～7...

【专利技术属性】
技术研发人员：林佳科，王晓雨，唐睿康，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：