一种阶段调控pH培养阿克曼氏菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种阶段调控pH培养阿克曼氏菌的方法，可改善阿克曼氏菌生长情况且提高细胞疏水性。本发明专利技术分为血清瓶摇瓶培养以及发酵罐培养两部分。所述血清瓶摇瓶培养采用控制初始pH，所述发酵罐培养采用添加碳酸钠和氢氧化钠，并且在生长延滞期、指数期及稳定期分别控制不同的pH环境，可提高菌体生长速度，避免生长后期生物量的快速下降，且可以提高其细胞疏水性，有利于阿克曼氏菌在肠道中的定植，为阿克曼氏菌的培养和应用奠定基础。阿克曼氏菌的培养和应用奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种阶段调控pH培养阿克曼氏菌的方法


[0001]本专利技术属于微生物培养
，具体涉及阿克曼氏菌的培养方法。

技术介绍

[0002]阿克曼氏菌(A.muciniphila)被发掘于人体肠道中，是一种潜在益生菌，对人体的健康十分有益，可以调节人体代谢以及肠道内微生物平衡，参与人体多种免疫途径，与诸多人体疾病相关。阿克曼氏菌能增加小鼠的葡萄糖耐受量以及改善胰岛素敏感性，有效预防肥胖；阿克曼氏菌还可以刺激L细胞释放胰高血糖素样肽
‑
1(GLP
‑
1)和胰高血糖素样肽
‑
2(GLP
‑
2)，从而控制血糖；此外，阿克曼氏菌可以有效改善靶向PD
‑
1/PD
‑
L1轴的免疫检查点抑制剂(ICIs)的原发性抵抗，令ICIs发挥临床疗效，使PD
‑
1在抗癌免疫疗效中发挥关键作用。因此，阿克曼氏菌在人类疾病治疗等方面具有巨大的应用前景。
[0003]阿克曼氏菌定植于肠道黏液层中，无鞭毛，不产芽孢，不运动，为革兰氏阴性菌，细胞形态普遍呈椭圆形，在胃肠道中以黏蛋白为碳源和氮源。黏蛋白培养基和脑心浸液培养基是阿克曼氏菌常用培养基，但黏蛋白培养基配制操作复杂，脑心浸液培养基培养效果较差，并且两种培养基成本高，不利于工业化规模培养。随后，Belzer采用大豆蛋白胨、葡萄糖、N
‑
乙酰氨基葡萄糖(N
‑
acetyl
‑
D
‑
(+)
‑
glucosamine，GlcNAc)代替动物源的黏蛋白，观察到阿克曼氏菌生长良好，但其中GlcNAc成本较高；且当该培养基中不添加黏蛋白或者GlcNAc时，生物量达最高值后会迅速急剧下降，不利于细胞活性的保持以及后续应用。因此，改善阿克曼氏菌培养后期的稳定性问题十分必要。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种阶段调控pH培养阿克曼氏菌的方法。
[0005]本专利技术经研究发现，阿克曼氏菌的培养与pH密切相关。本专利技术的核心点在于pH调控，根据具体培养环境的不同又可分为血清瓶摇瓶培养和发酵罐培养两部分。血清瓶摇瓶培养采用控制初始pH的方法；发酵罐培养采用分阶段调节pH的方法，且发酵罐培养中分阶段加入碳酸钠和氢氧化钠。本专利技术通过在血清瓶摇瓶培养和发酵罐培养中不同的pH控制以及分阶段添加碳酸钠溶液和氢氧化钠溶液的方法，可提高阿克曼氏菌的生长速度，避免生长后期生物量的快速下降，且可以提高其细胞疏水性，有利于阿克曼氏菌在肠道中的定植。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007]一种阶段调控pH培养阿克曼氏菌的方法，在血清瓶摇瓶培养中，控制血清瓶摇瓶发酵培养基的初始pH(所述初始pH值即接种阿克曼氏菌时的培养基pH值)为微碱性环境，优选pH为7.0～7.5；或者，在发酵罐培养中，在阿克曼氏菌的生长延滞期及指数期控制发酵罐发酵培养基的pH为微碱性环境，pH范围为7.0～8.0，在阿克曼氏菌达到生物量最高值时(相当于稳定期)控制发酵罐发酵培养基的pH为微酸性环境，pH范围为6.0～7.0。
[0008]需要说明的是，本专利技术所述的“生长延滞期”、“指数期”、“指数生长阶段”等术语是
基于菌的生长曲线，菌的生长曲线指的是以时间为横坐标、以菌的生物量(以OD值或活菌数的对数等体现)为纵坐标得到的一条曲线，菌的生长曲线显示了菌生长繁殖的4个时期：调整期(又称生长延滞期、迟缓期)、对数期(又称指数生长阶段、指数期)、稳定期(又称平台期，此阶段的生物量达到最高值且保持相对稳定)、衰亡期。
[0009]进一步地，在所述发酵罐培养中，在阿克曼氏菌接种时以及生长延滞期加入Na2CO3溶液，调节pH和提供阿克曼氏菌合适的缓冲体系氛围，Na2CO3溶液的浓度优选为1～3M；在阿克曼氏菌的指数期加入NaOH溶液，调节快速变化的pH，NaOH溶液的浓度优选为1～3M。
[0010]在本专利技术的一实施例中，所述阿克曼氏菌在血清瓶摇瓶培养或发酵罐培养之前先进行种子培养，将阿克曼氏菌的保种菌株接入种子培养基中，经两次复苏后接种于血清瓶摇瓶发酵培养基进行血清瓶摇瓶培养，或接种于发酵罐发酵培养基进行发酵罐培养。
[0011]进一步地，所述种子培养的方法包括：将保种菌株接入种子培养基中，36～38℃、80～120rpm培养22～26h后为一级种子液；取一级种子液接种于种子培养基中，接种量(本专利技术所述的接种量是指接种的菌液的体积和培养基体积的比例)为1:24～26，36～38℃、80～120rpm培养为二级种子液；将所述二级种子液用于血清瓶摇瓶培养或发酵罐培养。
[0012]进一步地，所述血清瓶摇瓶培养的方法包括：取二级种子液离心弃上清后，菌体沉淀接种于血清瓶摇瓶发酵培养基，接种量为1:24～26，36～38℃、80～120rpm培养46～50h。
[0013]进一步地，所述发酵罐培养的方法包括：取二级种子液接种于发酵罐发酵培养基，持续通入无氧气体，接种量为1:8～12，36～38℃、80～120rpm培养46～50h。
[0014]进一步地，所述种子培养基为脑心浸液培养基；具体地，所述种子培养基含有脑心浸粉36～38g/L，半胱氨酸0.3～0.5g/L。
[0015]进一步地，所述血清瓶摇瓶发酵培养基含有葡萄糖9～11g/L，胰蛋白胨24～26g/L，半胱氨酸0.3～0.5g/L，维生素溶液0.8～1.2mL/L，酸痕量溶液0.8～1.2mL/L，碱痕量溶液0.8～1.2mL/L，NaHCO
3 3～5g/L，KH2PO
4 0.3～0.5g/L，Na2HPO4·
12H2O 1.3～1.4g/L，NH4Cl 0.2～0.4g/L，NaCl 0.2～0.4g/L，MgCl2·
6H2O 0.08～0.12g/L，CaCl
2 0.1～0.12g/L。所述维生素溶液优选SIGMA混合维生素溶液。
[0016]进一步地，所述发酵罐发酵培养基含有初始葡萄糖14～16g/L，胰蛋白胨36～38g/L，半胱氨酸0.7～0.9g/L，维生素溶液0.8～1.2mL/L，酸痕量溶液0.8～1.2mL/L，碱痕量溶液0.8～1.2mL/L，NaHCO
3 3～5g/L，KH2PO
4 0.3～0.5g/L，Na2HPO4·
12H2O 1.3～1.4g/L，NH4Cl 0.2～0.4g/L，NaCl 0.2～0.4g/L，MgCl2·
6H2O 0.08～0.12g/L，CaCl
2 0.1～0.12g/L。所述维生素溶液优选SIGMA混合维生素溶液。
[0017]本专利技术采用阶段调控pH的方法，在以葡萄糖为单一碳源、胰蛋白胨为单一氮源的培养基中，摇瓶培养控制初始pH，发酵罐分阶段加入碳酸钠和氢氧化钠调节pH，调控阿克曼氏菌的生长环境，改善本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种阶段调控pH培养阿克曼氏菌的方法，其特征在于：在血清瓶摇瓶培养中，控制血清瓶摇瓶发酵培养基的初始pH为7.0～7.5；或者，在发酵罐培养中，在阿克曼氏菌的生长延滞期及指数期控制发酵罐发酵培养基的pH为7.0～8.0，在阿克曼氏菌达到生物量最高值时控制发酵罐发酵培养基的pH为6.0～7.0。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述发酵罐培养中，在阿克曼氏菌接种时以及生长延滞期加入Na2CO3溶液；在阿克曼氏菌的指数期加入NaOH溶液。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述Na2CO3溶液的浓度为1～3M；所述NaOH溶液的浓度为1～3M。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述阿克曼氏菌在血清瓶摇瓶培养或发酵罐培养之前先进行种子培养，将阿克曼氏菌的保种菌株接入种子培养基中，经两次复苏后接种于血清瓶摇瓶发酵培养基进行血清瓶摇瓶培养，或接种于发酵罐发酵培养基进行发酵罐培养。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述种子培养的方法包括：将保种菌株接入种子培养基中，36～38℃、80～120rpm培养22～26h后为一级种子液；取一级种子液接种于种子培养基中，接种量为1:24～26，36～38℃、80～120rpm培养为二级种子液；将所述二级种子液用于血清瓶摇瓶培养或发酵罐培养。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述血清瓶摇瓶培养的方法包括：取二级种子液离心弃上清后，菌体沉淀接种于血清瓶摇瓶发酵培养基，接种量为1:24～26，36～38℃、80～120rpm培养46～50h。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵罐培养的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：凌雪萍，杨瑞雄，吴海艇，卢英华，陈翠雪，姚传义，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：