抗猪GasderminD蛋白单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了抗猪Gasdermin D蛋白单克隆抗体及其应用。本发明专利技术提供五株小鼠抗猪GSDMD蛋白的单抗，并建立了利用所述单抗对猪GSDMD蛋白进行免疫印迹和免疫荧光检测的方法。结果表明，五株单抗均能够特异性识别猪GSDMD全长蛋白(GSDMD

【技术实现步骤摘要】
抗猪Gasdermin D蛋白单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体地说，涉及抗猪Gasdermin D(GSDMD)蛋白单克隆抗体及其应用。

技术介绍

[0002]“生老病死”是自然界生命体的基本运行规律，细胞作为生物体的基本结构和功能单位，也经历着增殖、分化、衰老和死亡等生命进程。为了更明确地对细胞死亡做出判定，细胞死亡命名委员会(Nomenclature Committee on Cell Death，NCCD)对其进行了定义和解释：细胞死亡是指细胞到达生命终点，并处于不可逆转的状态。细胞死亡是机体免疫应答的重要组成部分，是机体的一种保护机制，可以帮助机体消除内源性和外源性伤害，生命体正是在细胞存活与死亡的动态平衡中，维持各个组织器官的基本功能及机体稳态。
[0003]细胞焦亡(Pyroptosis)又称“细胞炎性坏死”，是一种程序性的炎性细胞死亡形式，也是机体维持自身免疫稳态的途径之一。在细胞焦亡激活过程中，细胞因子的释放可能有助于组织血管的生成，但细胞焦亡的过度活化可导致剧烈的炎症反应，使受损组织和器官修复不当，引发炎症性疾病，如动脉粥样硬化、肝脏组织炎症、败血症和炎症性肠病等。细胞焦亡参与先天性免疫应答，抑制侵入宿主细胞内的病原体的复制，激活免疫细胞吞噬并杀灭病原体；然而，一旦细胞焦亡失去控制，邻近细胞和组织中的炎症反应就会被激活，进一步加重炎性损伤，引发全身炎症反应，最终导致器官衰竭或败血性休克。因此，细胞焦亡是一把双刃剑，阐明细胞焦亡的特征、分子机制及其与感染性、炎症性疾病的关系对于研发靶向治疗药物具有重要意义。
[0004]细胞焦亡激活的关键执行分子是Gasdermin(GSDM)家族蛋白，由活化后的Gasdermin家族蛋白介导质膜形成直径1～2nm小阳离子渗透孔，可导致细胞离子梯度消失，引起细胞肿胀破裂，释放IL
‑
1β、IL
‑
18等炎症介质，进而招募更多的炎性细胞浸润，扩大炎症反应。狭义的细胞焦亡指依赖于上游炎症小体和炎性Caspase激活所触发的GSDMs依赖的炎性细胞死亡过程；而实际上GSDM
‑
NT的成孔活性并非都依赖于Caspase活性，颗粒酶、弹性蛋白酶等其他蛋白酶也能够切割活化GSDM蛋白，因此细胞焦亡的定义被扩展为由成孔活性的GSDM
‑
NT介导的细胞死亡形式。
[0005]GSDM家族蛋白由三个基本结构域组成，分别为具有膜成孔活性的N端结构域(成孔结构域)、抑制N端成孔活性的C端结构域(抑制结构域)以及连接N端和C端结构域的柔性连接结构域(linker)。以GSDMD为例，炎性Caspase在GSDMD的linker区域进行切割，产生一个约31kDa的GSDMD
‑
NT和一个约22kDa的GSDMD
‑
CT，其中GSDMD
‑
NT释放后能够转位至细胞膜，并在细胞膜上寡聚形成孔洞，导致细胞膜完整性被破坏，进而引起细胞焦亡。
[0006]截至目前，已发现人类GSDM蛋白家族中存在6个同源基因，分别为GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和PJVK。小鼠和大鼠缺乏GSDMB，但除了Gsdmd、Gsdme和Pjvk外，小鼠还具有三个GSDMA同源体(Gsdma1、Gsdma2、Gsdma3)和四个GSDMC同源体(Gsdmc1、Gsdmc2、Gsdmc3、Gsdmc4)。GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME在猪的基因组中均存在。其中，由GSDMD
介导的细胞焦亡途径是近年来的研究热点，GSDMD在不同的组织以及白细胞的不同亚群中广泛表达，尤其在巨噬细胞、核树突状细胞中高表达。
[0007]由GSDMD介导的细胞焦亡的发生机制可分为经典途径和非经典途径两种，其中经典途径依赖于Caspase
‑
1的激活，非经典途径则由人Caspase
‑
4/5或者鼠Caspase
‑
11介导。在经典途径中，当病原微生物感染宿主细胞时，病原相关分子模式(Pathogen
‑
associated molecular patterns，PAMPs)被宿主细胞内部相应的模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)所识别，PRRs被激活后能直接招募Caspase
‑
1或间接通过接头蛋白ASC进而招募Caspase
‑
1导致其发生自剪切激活。活化的Caspase
‑
1一方面可以切割IL
‑
1β和IL
‑
18前体，介导IL
‑
1β和IL
‑
18的成熟；另一方面，Caspase
‑
1还可以将GSDMD切割成具有膜穿孔活性的GSDMD
‑
NT片段，同时成熟的IL
‑
1β和IL
‑
18通过GSDMD
‑
NT寡聚孔被释放到胞外，触发剧烈的炎症反应。在非经典途径中，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)可以直接结合并激活Caspase
‑
4/5/11，活化的Caspase
‑
4/5/11也可以切割GSDMD，产生有活性的GSDMD
‑
NT片段，进而导致细胞焦亡；同时，活化的Caspase
‑
4/5/11也可以激活Pannexin
‑
1，引起ATP释放，进而引起胞膜通道P2X7的开放，最终使细胞膜形成小孔发生细胞焦亡，被激活的Pannexin
‑
1还通过引起K
+
的外释，进而活化NLRP3炎症小体，最终导致IL
‑
1β的成熟与释放，扩大炎症反应。
[0008]除上述两种依赖于炎性Caspase的激活途径外，耶尔森菌产生的效应因子耶尔森菌外部蛋白J(Yop J)能够引起宿主细胞内Caspase
‑
8依赖的GSDMD切割，GSDMD还可被其他蛋白酶(如弹性蛋白酶和组织蛋白酶G)所切割而活化。
[0009]众所周知，特异性抗体尤其是单克隆抗体是研究蛋白质功能的重要工具，而目前商品化的GSDMD抗体均是针对人或鼠GSDMD蛋白的特异性抗体，鲜有针对其他物种(例如猪)GSDMD蛋白的特异性抗体，致使针对其他物种GSDMD蛋白的生物学功能研究以及细胞焦亡研究难以开展。因此，制备针对猪GSDMD蛋白的特异性单克隆抗体，不仅具有广阔的商品化生产前景，而且具有良好的市场需求。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的是提供抗猪Gasdermin D蛋白单克隆抗体及其应用。
[0011]为了实现本专利技术目的，首先利用原核表达系统表达猪GSDMD全长蛋白(GSDMD
‑
FL)，将纯化的GSDMD...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗猪Gasdermin D蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体选自15H6、19H3、23H10、27A10中的任一种；其中，15H6的重链互补决定区的氨基酸序列如下：CDR
‑
H1:DYSIHCDR
‑
H2:WINTATHEPKYADDFKGCDR
‑
H3:DAYYWYFDV15H6的轻链互补决定区的氨基酸序列如下：CDR
‑
L1:RASKSVSTSGYSYMHCDR
‑
L2:LVSNLESCDR
‑
L3:QHIR19H3的重链互补决定区的氨基酸序列如下：CDR
‑
H1:TSWMSCDR
‑
H2:EVRLKSDNYAKHYAESVKGCDR
‑
H3:LIN19H3的轻链互补决定区的氨基酸序列如下：CDR
‑
L1:RASKSVSTSGYSYMHCDR
‑
L2:LVSNLESCDR
‑
L3:QHIR23H10的重链互补决定区的氨基酸序列如下：CDR
‑
H1:TYWIHCDR
‑
H2:FINPATGYTEYNQKFKDCDR
‑
H3:YYRDDGGDY23H10的轻链互补决定区的氨基酸序列如下：CDR
‑
L1:RASKSVSTSGYSYMHCDR
‑
L2:LVSNLESCDR
‑
L3:Q...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永宁，杨敏卉，周磊，盖新娜，韩军，郭鑫，杨汉春，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：