融合蛋白的制造方法技术

一种融合蛋白的制造方法，其中，所述融合蛋白包含BDNF以及抗转铁蛋白受体抗体或其片段，所述融合蛋白的制造方法包括以下工序：在蛋白质生产用培养基中培养含有编码上述融合蛋白的基因和编码外源性伴侣蛋白的基因的经转化的哺乳动物细胞，来生产上述融合蛋白；以及对所生产的上述融合蛋白进行回收，其中，编码上述融合蛋白的基因包含编码上述BDNF的基因的碱基序列和编码上述抗转铁蛋白受体抗体或其片段的基因的碱基序列，上述伴侣蛋白包含选自由HSP90α、HSP90β、CDC37、HSP70、HSP40、HSP60、HSP10、HSP110以及HSP27构成的组中的一种以上。种以上。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】融合蛋白的制造方法


[0001]本专利技术涉及一种融合蛋白的制造方法。

技术介绍

[0002]目前，重组蛋白在广泛的领域中使用。由于近年的生物医药品的发展，其重要性进一步提高。重组蛋白主要以大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等作为宿主细胞而制造(例如，日本特表2007－524381号公报(专利文献1))。当使用这些宿主细胞时，可以在短时间内得到大量的重组蛋白。另一方面，由于所表达的重组蛋白未进行正确的折叠、或未进行翻译后修饰等(例如，糖基化等)等理由，有时无法发挥该重组蛋白所具有的原本的功能。
[0003]特别是，作为难表达性蛋白质(Difficult to Express Protein：DEP)的脑源性神经营养因子(BDNF：Brain
‑
derived neurotrophic factor)是神经营养素家族(Neurotrophin Family)之一。已知BDNF的二聚体与位于靶细胞表面上的高亲和性BDNF受体(也被称为TrkB；酪氨酸受体激酶Tyrosine receptor kinase B，原肌球蛋白受体激酶Tropomyosin receptor kinase B，或原肌球蛋白相关激酶Tropomyosin
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related Kinase B)特异性结合，对中枢神经系统和末梢神经系统的细胞的分化、功能维持、突触形成、以及损伤时的再生和修复等发挥重要的作用(非专利文献2和非专利文献3)。由此，期待BDNF作为阿尔兹海默病、帕金森病、亨廷顿病等神经退行性疾病，肌萎缩侧索硬化症等脊柱退行性疾病，以及糖尿病神经病变、脑缺血性疾病、发育障碍、精神分裂症、抑郁症以及Rett综合征等多种疾病的治疗剂的开发。然而，已知BDNF难以作为重组蛋白大量地制造。
[0004]此外，已知包含BDNF和抗转铁蛋白受体抗体的融合蛋白作为由于BDNF穿过血脑屏障而能够入脑的融合蛋白(专利文献2和专利文献3)，但要求将其作为重组蛋白大量地制造的方法。
[0005]现有技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献1：日本特表2007－524381号公报
[0008]专利文献2：国际公开第2016/208696号
[0009]专利文献3：国际公开第2018/124107号
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1：Lee et al.,Journal of Biotechnology 143(2009)34－43
[0012]非专利文献2：Moses V.Chao.Nature Reviews Neuroscience.4.299－309(2003)
[0013]非专利文献3：Bollen E.Behavioural Brain Research.257C.8－12(2013)

技术实现思路

[0014]专利技术所要解决的问题
[0015]还期望开发能够大量地制造包含上述BDNF以及抗转铁蛋白受体抗体或其片段的融合蛋白的方法。
[0016]本专利技术是鉴于上述情况而完成的，本专利技术所要解决的技术问题在于提供生产效率提高的融合蛋白的制造方法。
[0017]用于解决问题的方案
[0018]本专利技术人等为了解决上述技术问题而进行了深入研究，结果发现如下事实，通过在作为宿主细胞的哺乳动物细胞中使编码包含BDNF以及抗转铁蛋白受体抗体或其片段的融合蛋白的基因与编码规定的伴侣蛋白的基因共同表达，上述融合蛋白的生产效率提高，从而完成了本专利技术。即，本专利技术如下所述。
[0019][1]本专利技术的融合蛋白的制造方法是包含BDNF以及抗转铁蛋白受体抗体或其片段的融合蛋白的制造方法，包括以下工序：在蛋白质生产用培养基中培养含有编码上述融合蛋白的基因和编码外源性伴侣蛋白的基因的经转化的哺乳动物细胞，来生产上述融合蛋白；以及对所生产的上述融合蛋白进行回收，其中，编码上述融合蛋白的基因包含编码上述BDNF的基因的碱基序列和编码上述抗转铁蛋白受体抗体或其片段的基因的碱基序列，上述伴侣蛋白包含选自由HSP90α、HSP90β、CDC37、HSP70、HSP40、HSP60、HSP10、HSP110以及HSP27构成的组中的一种以上。
[0020][2]本专利技术的融合蛋白的制造方法是包含上述BDNF以及上述抗转铁蛋白受体抗体或其片段的融合蛋白的制造方法，包括以下工序：准备哺乳动物细胞；使用编码上述融合蛋白的基因和编码上述伴侣蛋白的基因，对上述哺乳动物细胞进行转化；在蛋白质生产用培养基中培养经转化的上述哺乳动物细胞，来生产上述融合蛋白；以及对所生产的上述融合蛋白进行回收，其中，编码上述融合蛋白的基因包含编码上述BDNF的基因的碱基序列和编码上述抗转铁蛋白受体抗体或其片段的基因的碱基序列，上述伴侣蛋白包含选自由HSP90α、HSP90β、CDC37、HSP70、HSP40、HSP60、HSP10、HSP110以及HSP27构成的组中的一种以上。
[0021][3]优选的是，在上述[2]所述的融合蛋白的制造方法中，对上述哺乳动物细胞进行转化的工序使用含有编码上述融合蛋白的基因和编码上述伴侣蛋白的基因的一种以上重组蛋白表达载体来实施。
[0022][4]优选的是，在上述[2]所述的融合蛋白的制造方法中，对上述哺乳动物细胞进行转化的工序通过使含有编码上述融合蛋白的基因的一种以上重组蛋白表达载体、以及含有编码上述伴侣蛋白的基因的一种以上表达增强载体同时或分别与上述哺乳动物细胞接触来实施。
[0023][5]本专利技术的融合蛋白的制造方法是包含上述BDNF以及上述抗转铁蛋白受体抗体或其片段的融合蛋白的制造方法，包括以下工序：准备哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞包含含有编码上述融合蛋白的基因的一种以上重组蛋白表达载体；使用含有编码上述伴侣蛋白的基因的至少一种表达增强载体，对上述哺乳动物细胞进行转化；在蛋白质生产用培养基中培养经转化的上述哺乳动物细胞，来生产上述融合蛋白；以及对所生产的上述融合蛋白进行回收，其中，编码上述融合蛋白的基因包含编码上述BDNF的基因的碱基序列和编码上述抗转铁蛋白受体抗体或其片段的基因的碱基序列，上述伴侣蛋白包含选自由HSP90α、HSP90β、CDC37、HSP70、HSP40、HSP60、HSP10、HSP110以及HSP27构成的组中的一种以上。
[0024][6]优选的是，在上述[5]所述的融合蛋白的制造方法中，上述表达增强载体包含：第一表达增强载体，含有编码第一伴侣蛋白的基因；以及第二表达增强载体，含有编码第二伴侣蛋白的基因，上述第一伴侣蛋白与上述第二伴侣蛋白不同。
[0025][7]优选的是，上述伴侣蛋白包含HSP90α和CDC37中的任一者或两者。
[0026][8]优选的是，上述BDNF直接或借助连接肽与上述抗转铁蛋白受体抗体或其片段结合。
[0027][9]优选的是，上述连接肽包含选自由Gly、Ser、Gly－Ser、Gly－Gly－Ser、Gl本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种融合蛋白的制造方法，其中，所述融合蛋白包含BDNF以及抗转铁蛋白受体抗体或其片段，所述融合蛋白的制造方法包括以下工序：在蛋白质生产用培养基中培养含有编码所述融合蛋白的基因和编码外源性伴侣蛋白的基因的经转化的哺乳动物细胞，来生产所述融合蛋白；以及对所生产的所述融合蛋白进行回收，其中，编码所述融合蛋白的基因包含编码所述BDNF的基因的碱基序列和编码所述抗转铁蛋白受体抗体或其片段的基因的碱基序列，所述伴侣蛋白包含选自由HSP90α、HSP90β、CDC37、HSP70、HSP40、HSP60、HSP10、HSP110以及HSP27构成的组中的一种以上。2.根据权利要求1所述的融合蛋白的制造方法，其中，所述融合蛋白包含所述BDNF以及所述抗转铁蛋白受体抗体或其片段，所述融合蛋白的制造方法包括以下工序：准备哺乳动物细胞；使用编码所述融合蛋白的基因和编码所述伴侣蛋白的基因，对所述哺乳动物细胞进行转化；在蛋白质生产用培养基中培养经转化的所述哺乳动物细胞，来生产所述融合蛋白；以及对所生产的所述融合蛋白进行回收，其中，编码所述融合蛋白的基因包含编码所述BDNF的基因的碱基序列和编码所述抗转铁蛋白受体抗体或其片段的基因的碱基序列，所述伴侣蛋白包含选自由HSP90α、HSP90β、CDC37、HSP70、HSP40、HSP60、HSP10、HSP110以及HSP27构成的组中的一种以上。3.根据权利要求2所述的融合蛋白的制造方法，其中，对所述哺乳动物细胞进行转化的工序使用含有编码所述融合蛋白的基因和编码所述伴侣蛋白的基因的一种以上重组蛋白表达载体来实施。4.根据权利要求2所述的融合蛋白的制造方法，其中，对所述哺乳动物细胞进行转化的工序通过使含有编码所述融合蛋白的基因的一种以上重组蛋白表达载体、以及含有编码所述伴侣蛋白的基因的一种以上表达增强载体同时或分别与所述哺乳动物细胞接触来实施。5.根据权利要求1所述的融合蛋白的制造方法，其中，所述融合蛋白包含所述BDNF以及所述抗转铁蛋白受体抗体或其片段，所述融合蛋白的制造方法包括以下工序：准备哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含含有编码所述融合蛋白的基因的一种以上重组蛋白表达载体；使用含有编码所述伴侣蛋白的基因的至少一种表达增强载体，对所述哺乳动物细胞进行转化；在蛋白质生产用培养基中培养经转化的所述哺乳动物细胞，来生产所述融合蛋白；以及
对所生产的所述融合蛋白进行回收，其中，编码所述融合蛋白的基因包含编码所述BDNF的基因的碱基序列和编码所述抗转铁蛋白受体抗体或其片段的基因的碱基序列，所述伴侣蛋白包含选自由HSP90α、HSP90β、CDC37、HSP70、HSP40、HSP6...

【专利技术属性】
技术研发人员：永田英孝，林纹连，浅田玲子，泷川健司，
申请(专利权)人：住友制药株式会社，
类型：发明
国别省市：