用于检测西瓜耐盐性状的SNP位点、基于该位点的分子标记及应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及用于检测西瓜耐盐性状的SNP位点、基于该位点的分子标记及应用。本发明专利技术的分子标记能够从分子水平鉴定西瓜耐盐性，可以直接用于西瓜耐盐品种的分子标记辅助育种，提高育种的选择效率，加快育种进程；另外该分子标记能够为西瓜耐盐基因ClDREB2A的克隆、分子标记辅助育种体系的建立奠定基础，同时也为西瓜耐盐调控网络的研究奠定基础。究奠定基础。究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
用于检测西瓜耐盐性状的SNP位点、基于该位点的分子标记及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及用于检测西瓜耐盐性状的SNP位点、基于该位点的分子标记及应用。

技术介绍

[0002]西瓜(Citrullus lanatus)味美多汁，是自然的天然饮料，营养丰富且不含脂肪和胆固醇，深受人们喜爱。我国是世界上西瓜生产和消费第一大国，2021年的面积和产量分别达140万公顷和6086万吨，西瓜产业在增加农民收入、提高生活水平方面发挥了重要作用。然而，西瓜是一种盐敏感作物，盐胁迫对西瓜植株产生不利影响，导致产量和品质严重下降。国内西瓜主产区土壤漫灌加之过量施用化肥和多年连作，由此产生的土壤盐胁迫问题已成为限制我国西瓜健康生产的主要因素之一。
[0003]针对西瓜耐盐胁迫的研究不够深入，多数集中于化学物质的利用及砧木的筛选上，耐盐相关基因的研究仅以少数反向遗传学的方法开展，获得的耐盐相关基因均不是关键基因，调控西瓜耐盐的分子机理仍不清晰，仍需继续挖掘直接调控西瓜耐盐的关键基因。因此，很有必要从正向遗传学角度出发，探究西瓜应答盐胁迫的机理、发掘关键耐盐基因，进而解析调控西瓜耐盐性的分子机制。近年来，高质量的西瓜基因组组装结合大规模基因组重测序阐明了西瓜果实品质和抗性的选择驯化过程。在研究西瓜复杂表型性状时，越来越多的研究人员选择利用高通量测序数据开展与西瓜性状相关的GWAS分析，极大方便了西瓜育种工作。然而，利用GWAS鉴定抗性基因尤其是耐盐基因的研究还未见报道。
[0004]因此，在西瓜中利用GWAS开展与耐盐性状相关的SNP位点筛选，进而挖掘耐盐相关关键基因具有重大潜力。另外，开发出和西瓜耐盐基因相关的分子标记，不仅可以为西瓜分子标记辅助选择培育耐盐西瓜新品种提供有效的帮助，同时也可以大大缩短育种进程并提高选择的准确性。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的之一在于提供了一个用于检测西瓜耐盐性状的SNP位点。所述SNP位点为西瓜基因组(http：//cucurbitgenomics.org/，V2)4号染色体上，第20966276位核苷酸G突变为T。
[0006]本专利技术目的之二在于提供一对用于扩增西瓜耐盐基因ClDREB2A的分子标记引物。
[0007]本专利技术目的之三在于提供一种上述分子标记在西瓜分子育种的应用。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]根据西瓜基因组(http：//cucurbitgenomics.org/，V2)4号染色体上ClDREB2A基因序列信息，设计耐盐基因ClDREB2A的分子标记。扩增耐盐基因ClDREB2A分子标记的引物对上游引物序列如SEQ.ID.NO.1所示，下游引物序列如SEQ.ID.NO.2所示。
[0010]所述分子标记命名为ClDREB2A，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，
所述SNP位点位于SEQ ID NO.3序列的第965位。
[0011]针对耐盐基因ClDREB2A分子标记，本专利技术提供了鉴定西瓜耐盐性状的方法，所述方法包括如下步骤：
[0012](1)提取西瓜植株组织的DNA；
[0013](2)PCR扩增：利用权利要求1所述的引物对，对步骤(1)所提取样品进行PCR扩增；
[0014](3)对步骤(2)中的扩增产物进行电泳检测，随后进行胶回收，并连接至克隆载体pTOPO
‑
Blunt(Aidlab，货号：301026AX)。
[0015](4)按照说明书所述引物对产物进行sanger测序。
[0016](5)根据步骤(3)的测序结果进行判定，具体标准为：
[0017]若克隆产物第49位碱基为G，其序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，则待测西瓜植株为耐盐西瓜材料，若克隆产物第49位碱基为T，其序列如序列表中SEQ ID NO.5所示，则待测西瓜植株为不耐盐西瓜材料。
[0018]具体地，步骤(2)所述PCR扩增的反应体系为：总体积20μL，包括6μL H2O，1μL 10mM上游引物，1μL 10mM下游引物，10μL 2
×
PCR MIX，2μL DNA。PCR检测的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；58℃退火20s；72℃延伸20s，共35个循环。步骤(3)电泳检测的琼脂糖胶浓度为1.5％。步骤(3)连接克隆载体的体系为：pTOPO
‑
Blunt 1μL，10x Enhancer 1μL，胶回收产物8μL，总体积10μL。
[0019]本专利技术还保护一种用于鉴定耐盐性状的试剂盒，所述试剂盒包含前述分子标记引物对。
[0020]另外，还保护上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定西瓜耐盐性状中的应用，采用含有所述分子标记引物对的试剂盒可以用于鉴定待测西瓜植株是否耐盐。
[0021]另外，用于检测前述分子标记是否存在的试剂或者包含所述试剂的试剂盒可以用于西瓜耐盐ClDREB2A基因定位，具体采用本领域常规的方法。
[0022]本专利技术的优点：
[0023]一方面，本专利技术的分子标记可实现对耐盐基因ClDREB2A片段的克隆，因此可直接用于西瓜耐盐材料的分子标记辅助育种，而由于分子标记在辅助育种体系中具有简便、快速、高通量的优势，因而本专利技术所提供的分子标记在耐盐新品种培育中具有较好的应用价值。
[0024]另外，利用该分子标记能够在出芽期或子叶期即可准确快速的鉴定出西瓜耐盐性状，具有检测方便、扩增产物稳定的优点。
[0025]本申请首次对西瓜耐盐性状相关基因进行了详细研究，利用GWAS分析最终确定两个与西瓜耐盐性状显著相关的两个SNP位点(分别位于4号染色体第第18520851位碱基和第20908124位碱基)。定位结果表明，两个SNP位点上下游200Kb区间内有39个基因，利用耐盐材料和不耐盐材料对着39个基因进行表达水平测定，发现耐盐基因ClDREB2A(Cla97C04G073300)在盐处理后的表达量显著高于盐处理之前，并且在ClDREB2A编码区的第965位发现SNP突变，即4号染色体上第20966276位核苷酸G突变为T。其一个碱基的突变导致氨基酸也发生变异Arg
322
→
Met
322
，导致西瓜不耐盐胁迫。这一发现为最终ClDREB2A基因的克隆、分子标记辅助育种体系的建立奠定基础，同时也有助于最终西瓜耐盐调控网络的研究奠定基础。总之，由于分子标记对于最终功能基因定位具有十分重要意义，加上分子标
记在分子标记育种体系建立中具有简便、快速、高通量的优势，因而使得本申请具有十分重要的应用价值，对于西瓜新品种培育也具有十分重要的保护意义。
附图说明
[0026]图1为基于GWAS挖掘西瓜幼苗耐盐关键基因；
[0027]利用GWAS分析挖掘与可溶性糖含量相关的两个SNP位点；
[0028]图1A为利用GW本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测西瓜耐盐性状的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点为西瓜基因组4号染色体上第20966276位核苷酸G突变为T。2.基于权利要求1所述SNP位点的与西瓜耐盐性相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记命名为C1DREB2A，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述SNP位点位于SEQ ID NO.3序列的第965位。3.根据权利要求2所述与西瓜耐盐性相关的分子标记，其特征在于，扩增ClDREB2A分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。4.权利要求2所述的分子标记在西瓜分子育种中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，所述分子标记用于鉴定或辅助鉴定西瓜耐盐性状。6.一种鉴定西瓜耐盐性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)提取西瓜植株组织的DNA；(2)PCR扩增：利用权利要求1所述的引物对，对步骤(1)所提取样品进行PCR扩增；(3)对产物进行sanger测序；(4)根据步骤(3)的测序结果进行判定，具体标准为：若克隆产物第49位碱基为G，其序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，则待测西瓜植株为耐盐西瓜材料，若克隆产物第49位碱...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁高鹏，朱迎春，孙德玺，安国林，李卫华，
申请(专利权)人：中国农业科学院西部农业研究中心，
类型：发明
国别省市：