一种基于链置换反应的肿瘤标志物荧光共检测方法及其在胃癌诊断中的应用技术

本发明专利技术提供了一种基于链置换反应的肿瘤标志物荧光共检测方法及其在胃癌诊断中的应用，肿瘤标志物miRNA与mRNA的荧光探针，包括一组用于miR

【技术实现步骤摘要】
一种基于链置换反应的肿瘤标志物荧光共检测方法及其在胃癌诊断中的应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种基于链置换反应的肿瘤标志物荧光共检测方法及其在胃癌诊断中的应用。

技术介绍

[0002]胃癌(GC)是全球第五大最常见的癌症类型，也是癌症死亡的第三大原因。由于GC起病隐匿，多数患者诊断为中晚期，预后较差，提示早期诊断对GC的防治和提高生存率至关重要。但临床常用的胃镜、CT等检查方法对早期肿瘤微病变的检出率较低。病理活检受限于其侵袭性，不适合人群筛查。传统的癌胚抗原(CEA)、碳水化合物抗原(CA)19
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9和CA72
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4等血清学肿瘤生物标志物由于敏感性和特异性较差，不足以用于GC检测。因此，开发临床可操作、敏感、无创的筛查方法，筛选有效的生物标志物用于GC的早期诊断势在必行。
[0003]肿瘤循环核酸作为实体细胞释放到血液循环系统中的特异性片段，保留了肿瘤特有的遗传特征，有效摆脱了对原代组织的依赖，为肿瘤的早期诊断提供了一种无创、快速、准确的方法。然而，其在临床实践中的广泛应用仍面临着巨大的挑战。一方面，由于恶性肿瘤具有异质性、多样性和复杂性，单一的核酸分子标记很难满足临床精准诊断的需要；另一方面，临床常用的包括RT
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qPCR在内的传统定量方法仍然依赖于酶、昂贵的设备和严格的温度控制。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对传统技术中存在的问题，提出一种基于链置换反应的肿瘤标志物荧光共检测方法及其在胃癌诊断中的应用
[0005]第一方面，本专利技术提供了一种基于链置换反应的肿瘤标志物miRNA与mRNA的荧光探针，包括一组用于miR
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5p检测的双链探针P1T1，一组用于PLS3检测的双链探针P2T2，一组基于链置换反应用于放大荧光信号的双链探针A1A2。
[0006]进一步的，用于miR
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5p miRNA检测的双链探针P1T1，miR
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5p序列如SEQ ID NO.1所示，P1修饰Cy5荧光分子序列如SEQ ID NO.2所示，T1修饰BHQ
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3分子序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]进一步的，用于PLS3检测的双链探针P2T2，PLS3序列如SEQ ID NO.4所示，P2修饰FAM荧光分子序列如SEQ ID NO.5所示，T2修饰BHQ
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1分子序列如SEQ ID NO.6所示。
[0008]进一步的，用于放大荧光信号的双链探针A1A2，A1序列如SEQ ID NO.7所示，A2序列如SEQ ID NO.8所示，A1和A2分别参与miR
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5p与P1T1、PLS3与P2T2之间的反应，通过链置换反应持续放大荧光信号，实现高灵敏检测。
[0009]第二方面，本专利技术提供了一种基于链置换反应的肿瘤标志物荧光共检测方法，包括以下步骤：
[0010](1)双链探针自组装：使用超纯水将探针溶解成50μM的溶液，分别取A1A2、P1T1、
P2T2梯度降温，使探针自组装形成浓度为10μM的双链探针溶液；
[0011](2)荧光检测流程：利用1
×
PBS缓冲液将A1A2、P1T1、P2T2稀释形成浓度为100nM的探针溶液，取A1A2、P1T1、P2T2探针溶液加入1
×
PBS缓冲液，滴加待测样本并吹打混匀，将溶液置于室温中反应，反应完成后利用Hitachi F7100荧光分光光度计检测荧光信号；
[0012](3)方法学评价：对检测方法的灵敏度、特异性、准确度以及共检测可行性进行方法学评价；
[0013](4)血清检测能力验证：向健康人血清中加入RNase A消化游离RNA，处理后加入不同浓度的目的分子，优化反应时间后利用上述样本评价该检测方法在血清背景下的检测能力；
[0014](5)建立基于miR
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5p和PLS3的胃癌联合诊断模型：收集46例胃癌患者和24例健康人血清的miR
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5p及PLS3的荧光信号，基于荧光强度利用MedCalc软件建立Logistics回归诊断模型，评价模型诊断效能。
[0015]进一步的，所述步骤(1)中的梯度退火过程为95℃5min
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65℃30min
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50℃30min
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37℃30min
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22℃30min
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4℃。
[0016]进一步的，所述步骤(2)中的反应体积为200μL，包括20μL待测样品、20μLA1A2、20μL P1T1、40μL P2T2和100μL 1
×
PBS缓冲液，反应时间为50min。
[0017]进一步的，所述步骤(2)中的检测流程分为2步，采用光谱扫描方式，第一步采用640nm波长激发，扫描660
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760nm波长范围内的发射光谱，取665nm处的荧光强度作为miR
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5p的荧光信号；第二步采用495nm波长激发，扫描515
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620nm波长范围内的发射光谱，取520nm处的荧光强度作为PLS3的荧光信号。
[0018]进一步的，所述步骤(4)中血清的检测流程分为2步，采用光谱扫描方式，第一步采用635nm波长激发，扫描655
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760nm波长范围内的发射光谱，取665nm处的荧光强度作为miR
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5p的荧光信号；第二步采用490nm波长激发，扫描510
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620nm波长范围内的发射光谱，取520nm处的荧光强度作为PLS3的荧光信号。
[0019]第三方面，本专利技术还提供了一种荧光生物传感器检测miR
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5p与PLS3所建立的胃癌诊断模型，诊断胃癌的曲线下面积为0.884，标准误为0.044，95％置信区间为0.785
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0.948，诊断灵敏度为0.913，特异度为0.75。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的反应原理为：在本传感系统中，用于miR
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5p识别的双链探针P1T1由包含荧光团Cy5标记的识别探针P1和BHQ
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3标记的探针T1组成，用于PLS3识别的P2T2复合物由FAM标记的P2和BHQ
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1标记的T2组成，双链探针A1A2可分别参与到P1T1与P2T2的反应用于信号扩增。由于各自的部分互补配对，在缺乏Target序列的情况下各双链探针可以以亚稳状态共存，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于链置换反应的肿瘤标志物荧光探针，其特征在于：包括一组用于miR
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5p检测的双链探针P1T1，一组用于PLS3检测的双链探针P2T2，一组基于链置换反应用于放大荧光信号的双链探针A1A2。2.根据权利要求1所述的一种基于链置换反应的肿瘤标志物荧光探针，其特征在于：用于miR
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5p miRNA检测的双链探针P1T1，miR
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5p序列如SEQ ID NO.1所示，P1修饰Cy5荧光分子序列如SEQ ID NO.2所示，T1修饰BHQ
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3分子序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求1所述的一种基于链置换反应的肿瘤标志物荧光探针，其特征在于：用于PLS3检测的双链探针P2T2，PLS3序列如SEQ ID NO.4所示，P2修饰FAM荧光分子序列如SEQ ID NO.5所示，T2修饰BHQ
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1分子序列如SEQ ID NO.6所示。4.根据权利要求1所述的一种基于链置换反应的肿瘤标志物荧光探针，其特征在于：用于放大荧光信号的双链探针A1A2，A1序列如SEQ ID NO.7所示，A2序列如SEQ ID NO.8所示，A1和A2分别参与miR
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5p与P1T1、PLS3与P2T2之间的反应，通过链置换反应持续放大荧光信号，实现高灵敏检测。5.根据权利要求1～4任意一项所述的一种基于链置换反应的肿瘤标志物荧光共检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)双链探针自组装：使用超纯水将探针溶解成50μM的溶液，分别取A1A2、P1T1、P2T2梯度降温，使探针自组装形成浓度为10μM的双链探针溶液；(2)荧光检测流程：利用1
×
PBS缓冲液将A1A2、P1T1、P2T2稀释形成浓度为100nM的探针溶液，取A1A2、P1T1、P2T2探针溶液加入1
×
PBS缓冲液，滴加待测样本并吹打混匀，将溶液置于室温中反应，反应完成后利用荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜鲁涛，张鹏，李娟，童尧，李培龙，王传新，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：