含羞草的繁殖方法技术

含羞草的繁殖方法，它在现有技术五步骤－－（１）外植体消毒、（２）萌发无菌苗、（３）诱导愈伤组织、（４）诱导不定芽发生和（５）培养生根的基础上对步骤（３）～（５）进行改进：步骤（３）采用ＭＳ＋２ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ＋０．２ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ培养基；步骤（４）采用ＭＳ或Ｂ５＋１．０－２．０ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０－０．５ｍｇ／Ｌ　　ＴＤＺ培养基；步骤（５）采用Ｂ５＋２ｍｇ／Ｌ　　ＩＡＡ的培养基、或者１／２ＭＳ＋０．５－２ｍｇ／Ｌ　　ＩＢＡ或ＮＡＡ培养基。本方法能明显提高含羞草的无性繁殖系数，且操作简便。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种植物组织培养方法，具体地讲，是指一种采用组织培养技术对含羞草离体培养进行快速繁殖的方法。
技术介绍
植物组织培养是指用植物的任何器官、组织或细胞，在人工控制条件下进行无菌培养生长发育的过程。该技术取材少，培养植物材料成本低，生长周期短，管理方便。利用植物组织培养这种快速繁殖技术，能在短时间内繁衍出大量保持母本生物特性和遗传性状的植株。据了解，我国快速繁殖的植物已有近千种。通常使用的基本培养基有数种，如MS、B5、White、N6等。在组织培养中，植物外植体要在植物生长物质的作用下，经过诱导脱分化、恢复细胞分裂的能力、影响再分化、促进器官形成等过程。植物外植体繁殖系数的大小，直接影响着生产后代植株的数量和质量。含羞草(Mimosa pudica L.)，别名知羞草、感应草，是豆科含羞草属多年生草本或半灌木，常做1年生栽培。原产美洲热带地区，早年引入我国，云南省西双版纳、德宏等热区均有逸生。各地作盆栽植物栽培，植物教学上常做实验材料。含羞草全株有小毒，供药用，有安神镇静、止血收敛之功效，鲜叶捣烂外敷可治带状疱症。含羞草中含有一种植物氨基酸—含羞草碱(mimosine)，最近已被定性为一种可逆性细胞周期抑制物，可与脱氧胸苷三磷酸在DNA复制点直接竞争。有关含羞草无性繁殖幼苗的组织培养方法在国内尚未有人报道，国际上仅有一例报道(Gharyal P K & Maheshwari S C，Plantlet formation intissue cultures of the sensitive plant Mimosa pudica L.International Journal ofPlant Physiology，1982，105(2)179-182)。其方法主要包括如下步骤(1)外植体消毒以种子为外植体，繁殖前先先进行消毒；(2)萌发无菌苗在B5培养基上萌发无菌苗；(3)诱导愈伤组织将无菌苗根、子叶、下胚轴、叶片、茎尖，分别放在附加有吲哚乙酸(简称IAA)、萘乙酸(简称NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(简称2，4-D)，6-苄基氨基嘌呤(简称6-BA)的B5固体培养基中诱导愈伤组织；(4)诱导不定芽发生愈伤组织转接到分化培养基B5+0.5mg/L 2，4-D+1mg/L 6-BA中诱导不定芽发生，其培养条件为温度25±2℃；光照强度750Lux；(5)培养生根将高度为3-7厘米的不定芽分切成单株，在附加2mg/L IAA固体培养基上培养，培养条件同步骤(4)。但经试验，该繁殖方法主要存在使用激素种类繁多，操作不方便，分化率低、生根率低等不足。(三)专利技术的内容本专利技术的目的在于针对含羞草已有组织培养方法的不足，提供一种快速繁殖的新方法，它能够明显提高含羞草的无性繁殖系数，而且操作简便。已知在调节控制植物材料离体培养过程中，培养基的种类对植物的分化有着一定的影响，植物生长物质也起着重要的作用，其中影响最显著的是生长素类和细胞分裂素类物质。为了实现本专利技术的目的，本专利技术在上述现有方法包括五步骤的基础上进行如下改进在步骤(3)中，减少激素种类，提高培养基中生长素和细胞分裂素的浓度，以提高诱导愈伤组织发生速率；减少步骤(4)中培养基所用激素的种类，仅用细胞分裂素类，以提高诱导不定芽发生的能力；对步骤(5)的培养基进行改进。具体的讲，本专利技术的具体操作如下(1)外植体消毒将含羞草种子置于65-75％乙醇中浸泡20-60s(表示“秒”，下同)，0.1％升汞中灭菌4-15min(表示“分钟”，下同，)，再用无菌水冲洗3-6次；(2)萌发无菌苗消毒后的种子接种到1/2MS培养基上培养15-30天，萌发出无菌苗，培养条件为温度25±2℃，光照强度1500Lux，光照时间12h·d-1(表示“小时/天”，下同)；(3)诱导愈伤组织将无菌苗置于配方为MS+2mg/L 2，4-D+0.2mg/L6-BA的培养基中诱导愈伤组织，培养时间为10-30天，培养条件同步骤(2)；(4)诱导不定芽发生将愈伤组织置于配方为MS或B5+1.0-2.0mg/L6-BA+0-0.5mg/L TDZ的培养基上培养30-60天获得不定芽(高度一般为3-7厘米)，培养条件同步骤(2)；(5)培养生根将步骤(4)所得到的不定芽分切成单株，在B5+2mg/LIAA的培养基、或者1/2MS+0.5-2mg/L IBA(吲哚丁酸)或NAA(萘乙酸)培养基上培养10-30天，培养条件同步骤(2)。上述方法中，在步骤(4)芽分化过程中，激素6-BA的浓度最好是2.0mg/L。步骤(5)中培养基最好是采用1/2MS+0.5-2mg/L IBA或NAA配方，它可以避免B5+2mg/L IAA配方中激素分解和操作不便的缺点，即吲哚乙酸在有光的条件下容易分解，并且在操作中要采用过滤灭菌的方法，而采用萘乙酸或者吲哚丁酸后使操作更方便，生根率提高；其中NAA的浓度最好是1.0mg/L。在本方法中，MS和B5培养基是最常用的培养基，一般从有关植物组织培养的书都可找到其配方。本专利技术具有如下的优点和效果1.经实验证明，与原有的方法比较，本专利技术方法步骤(3)愈伤组织的诱导率为100％；步骤(4)中，采用提高细胞分裂素浓度的方法，不定芽的诱导频率及每块外植体产生的芽数均高于原方法；在步骤(5)中，采用萘乙酸、吲哚丁酸替换原来的吲哚乙酸，不定根发生时间缩短，生根率增加，而且长势良好，保证了试管苗不定根质量。2.本专利技术方法与已有的常规方法相比，无需增加专有设备，操作简便。(四)具体的实施方式实施例1(1)外植体的消毒取羞草种子置于65％乙醇中浸泡20s，0.1％升汞中灭菌15min，再用无菌水冲洗3次；(2)无菌苗的萌发将已消毒的种子接种到1/2MS培养基上培养15天，获取无菌苗，培养条件为温度25±2℃，光照强度1500Lux，光照时间12h·d-1(表示“小时/天”，下同)；(3)愈伤组织的诱导取无菌苗下胚轴切段，转接到附加有2mg/L2，4-D和0.2mg/L 6-BA的MS培养基上培养30天，诱导愈伤组织，愈伤组织诱导率100％；(4)芽的分化一个月后接种到附加有1mg/L 6-BA和0.5mg/L TDZ的MS培养基上，培养两个月时，分化频率为40％，平均每块愈伤组织上小苗数为5-10个；(5)根的形成形成的的小苗，转接入附加2.0mg/L IAA的B5培养基上，30天时，生根率为50％。而采用原有方法培养的对照组，在添加多种激素的条件下，外植体愈伤组织诱导率达到100％，但此时有80％的愈伤组织产生根，不利于进一步的培养。其不定芽的发生率在其他外植体上最高为31％，在以下胚轴为外植体时仅为8％分化出芽，生长慢，明显差于本专利技术方法。本方案采用较少种类的激素就可使愈伤组织诱导率达到100％，此时没有根的形成，不定芽发生频率也高于对照9％。实施例2其它操作及对照组同实施例1，所不同的是步骤(1)中，取羞草种子置于75％乙醇中浸泡60s，0.1％升汞中灭菌4min，再用无菌水冲洗6次；步骤(2)中，培养时间为30天；步骤(3)中，培养时间为10天；步骤(4)中，培养基配方为MS+2mg/L 6-BA，培养时间为30天，不定芽分化率达到60％；步骤(5)中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含羞草的繁殖方法，其特征在于包括如下步骤：　　　　（１）外植体消毒：将含羞草种子置于６５－７５％乙醇中浸泡２０－６０ｓ，０．１％升汞中灭菌４－１５ｍｉｎ，再用无菌水冲洗３－６次；　　　　（２）萌发无菌苗：消毒后的种子接种到１／２ＭＳ培养基上培养１５－３０天，萌发出无菌苗，培养条件为温度２５±２℃，光照强度１５００Ｌｕｘ，光照时间１２ｈ.ｄ↑［－１］；　　　　（３）诱导愈伤组织：将无菌苗置于配方为ＭＳ＋２ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ＋０．２ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ的培养基中诱导愈伤组织，培养时间为１０－３０天，培养条件同步骤（２）；　　　　（４）诱导不定芽发生：将愈伤组织置于配方为ＭＳ或Ｂ５＋１．０－２．０ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０－０．５ｍｇ／Ｌ　　ＴＤＺ的培养基上培养３０－６０天获得不定芽，培养条件同步骤（２）；　　　　（５）培养生根：将步骤（４）所得到的不定芽分切成单株，在Ｂ５＋２ｍｇ／Ｌ　　ＩＡＡ的培养基、或者１／２ＭＳ＋０．５－２ｍｇ／Ｌ　　ＩＢＡ或ＮＡＡ培养基上培养１０－３０天，培养条件同步骤（２）。

【技术特征摘要】
1.一种含羞草的繁殖方法，其特征在于包括如下步骤(1)外植体消毒将含羞草种子置于65-75％乙醇中浸泡20-60s，0.1％升汞中灭菌4-15min，再用无菌水冲洗3-6次；(2)萌发无菌苗消毒后的种子接种到1/2MS培养基上培养15-30天，萌发出无菌苗，培养条件为温度25±2℃，光照强度1500Lux，光照时间12h·d-1；(3)诱导愈伤组织将无菌苗置于配方为MS+2mg/L 2，4-D+0.2mg/L6-BA的培养基中诱导愈伤组织，培养时间为10-30天，培养条件同步骤(2)；(4)诱导不定芽发生将愈伤组织置于配方为MS或B5+1.0-2.0mg/L6-...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈刚，李玲，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]