敲除油菜BnOPR3基因创造雄性不育和保持两用系的方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及敲除油菜BnOPR3基因创造雄性不育和保持两用系的方法。本发明专利技术提供了根据BnOPR3两个油菜同源基因在控制油菜雄性生殖发育中的应用，其中BnOPR3.A3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示；BnOPR3.C3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：4所示。本发明专利技术还提供了利用BnOPR3基因创造雄性不育和保持两用系的方法。保持两用系的方法。

【技术实现步骤摘要】
敲除油菜BnOPR3基因创造雄性不育和保持两用系的方法


[0001]本专利技术属于作物分子育种
，具体涉及一种敲除BnOPR3基因创制油菜雄性不育和保持两用系的方法。

技术介绍

[0002]雄性不育系是作物杂种优势利用和杂交制种的重要材料，主要包括细胞质雄性不育(简称CMS)和细胞核雄性不育(简称GMS)。CMS是由线粒体基因和核基因共同控制的，虽然已应用于油菜等作物的育种和杂交种生产中，但存在不育系胞质较为单一、易感病等问题。GMS由核基因单独控制，可以克服CMS缺陷，但很难通过常规育种方法大量繁殖纯合不育系。无论是细胞质雄性不育还是细胞核雄性不育，均涉及三系配套，需要制种田和繁殖田。光敏和温敏型雄性不育的出现使得三系育种能够简化为二系育种，具有一定的生产利用价值。二系法是将保持系与不育系合二为一，不受恢保关系制约，配组自由，易获得强优势组合。创造出育性稳定可靠的油菜雄性不育系且不育系繁种过程不存在50％的可育株，也无需人工拔除可育株，这些方法将给杂交油菜的生产带来历史性突破。
[0003]有资料显示，CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑在植物不育系的创制上已经得到有效的应用。通过CRISPR/Cas9基因编辑，敲除粳稻中的TMS5，开发出无转基因的TGMS系(Zhou et al.,2016)。敲除粳稻中的CARBON
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STARVED ANTHERS基因获得了PGMS突变体(Li et al.,2016；Gu et al.,2019)。Singh等对小麦Ms45的3个同源染色A、B和D的同源基因进行CRISPR/Cas9编辑，三个同源位点同时突变的突变体表现出雄性不育(Singh et al.,2018)。紫花苜蓿中OsNP1同源基因的靶向突变也导致了GMS系的产生(Ye et al.,2021)。对玉米中花粉发育和雄性生殖所需的多个同源基因，包括ZmDFR1、ZmDFR2、ZmACOS5
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1和ZmACOS5
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2，进行CRISPR/Cas9基因编辑，获得了新的玉米雄性不育系(Liu et al.,2022)。因此，通过基因编辑技术创造植物雄性不育系是一个便捷有效的手段。
[0004]与模式植物拟南芥和模式作物水稻相比，油菜中已克隆和鉴定的GMS基因和创制的雄性不育材料均相对较少。CRISPR/Cas9基因编辑技术由于成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点，被越来越广泛地应用于植物基因功能研究、作物遗传改良和育种等多个方面，应用前景十分广阔。利用CRISPR/Cas9技术挖掘鉴定油菜雄性不育候选基因和创制雄性不育材料，可以快速丰富油菜GMS基因和不育材料资源，从而促进油菜杂种优势应用，最终可以有效解决我国油菜种业行业长期面临缺乏稳定的油菜不育系和突破性大品种的瓶颈问题。
[0005]到目前为止，尚未见到有关BnOPR3基因与油菜雄性育性有关的报道，也没有利用该基因与CRISPR/Cas9系统在油菜中创制雄性不育系的报道，更没有利用所述基因创制突变体实现油菜“一系两用”，创造油菜新种质的报道。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供油菜BnOPR3基因及其在创制油菜雄性
不育系中的应用，该应用可以克服油菜现有杂交育种中细胞核雄性不育系繁种过程中存在50％的可育株，需要人工拔除的问题，提供一种创造油菜雄性不育和保持两用系的方法，从而实现“一系两用”创制油菜新种质材料的目的。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了BnOPR3基因在控制油菜雄性生殖发育中的应用。一般可以预见来自不同植物或不同十字花科材料中的OPR3同源基因具有相同或者相似的功能，因此同样可以利用这些基因改良植物的育性。进一步，即使不能预见这些基因的功能，本领域的一般技术人员可以根据本专利技术提供的方法和现有技术测定它们是否具有控制植物雄性育性的功能。
[0008]本专利技术还提供了根据BnOPR3两个油菜同源基因在控制油菜雄性生殖发育中的应用，所述BnOPR3.A3基因的序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示；BnOPR3.C3基因的序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：4所示。
[0009]在另一方面，本专利技术还提供了一种创制油菜雄性不育系的方法，其特征在于，抑制油菜中BnOPR3基因的表达和/或活性，选择油菜雄性不育的植株。
[0010]在一些实施方案中，上述抑制基因表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T
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DNA插入中任一种。
[0011]在一些实施方案中，上述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。
[0012]在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9方法包括：在BnOPR3.A3和BnOPR3.C3基因的第5外显子处设计1个CRISPR/Cas9载体靶点，所述靶点的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]在另一方面，本专利技术还提供一种获得BnOPR3基因雄性不育系的方法，将通过上述方法获得的BnOPR3基因雄性不育系与目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得BnOPR3基因雄性不育的性状和基因突变。
[0014]本专利技术还包括通过上述任一方法获得的BnOPR3基因雄性不育系在杂交育种和制种中的应用。所述在杂交育种和制种中的应用是指将BnOPR3基因雄性不育系作为母本与其他父本进行杂交，或是将获得的BnOPR3基因雄性不育系与其他目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得BnOPR3基因雄性不育的性状和基因突变。
[0015]本专利技术的优点及有益效果如下：
[0016]BnOPR3基因及其编码的蛋白调控油菜雄性生殖发育是之前没有报道过的。本专利技术通过利用CRISPR/Cas9方法同时突变油菜BnOPR3.A3和BnOPR3.C3基因，发现只有BnOPR3两个同源基因同时突变才能造成油菜雄性不育，而单突则对油菜花药和花粉发育无影响。利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法和编辑后获得的BnOPR3基因雄性不育突变体，可以创制油菜雄性不育系，从而可以应用于油菜杂交育种和制种。利用该突变体材料在油菜花蕾的后期通过外施适当浓度的茉莉酸甲酯(MeJA)，所述BnOPR3基因突变体的雄性育性可以被恢复，所得的下一代可保持不育性性状，即可以实现不育系与保持系之间的转换，克服了传统人工去雄方法的缺陷。
附图说明
[0017]图1：BnOPR3基因结构图以及sgRNA位置示意图。
[0018]图2：基因编辑载体示意图。
[0019]图3：BnOPR3基因纯合突变体序列。
[0020]图4：BnOPR3基因双拷贝纯合突变体以及单拷贝纯合突变体不育表现。附图标记说明：图4中的A图是BnOPR3基因双拷贝纯合突变体表现出完全不育；图4中的B图是BnOPR3基因单拷贝突变体变现出正常育性。
[0021]图5：BnOPR3基因双拷贝纯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一个油菜同源基因BnOPR3的BnOPR3.A3基因在控制油菜雄性生殖发育中的应用，其特征在于，所述BnOPR3.A3基因的CDS序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。2.一个油菜同源基因BnOPR3的BnOPR3.C3基因在控制油菜雄性生殖发育中的应用，其特征在于，所述BnOPR3.C3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。3.一种创制油菜雄性不育系的方法，其特征在于，抑制油菜中如权利要求1或2所述的基因的表达和/或活性，进而选择油菜雄性不育的植株。4.如权利要求3所述的方法，包括利用基因编辑、RNA干扰或T
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DNA插入中任一种方法。5.如权利要求4所述的方法，其中所述基因编辑的方法为CRISPR/Cas9方法。6.如权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：成洪涛，胡琼，郝梦宇，梅德圣，王会，汪文祥，温运飞，付丽，刘佳，李超，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：